g*********3
发帖数: 177 | 1 最近在做蛋白纯化，用的zymogen his6 column，elution完后，用SDS-LB煮了5分分钟
，发现western有若干条带。
实验室的人说是imidazole会降解蛋白。在网上查也有不少人说imidazole会降解蛋白。
请问各位是否遇到这样的问题。
谢谢。 |
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l***g
发帖数: 19 | 2 如果蛋白A和蛋白B结合，用GST-A和B-His6进行GST-pulldown可以得到很好的结果。体
外酶活性实验发现GST-A也可以很好的促进B-His6的酶活性，但是如果用A-His6就检测
不到B-His6酶活性的上升，所以我的问题是，A-His6和B-His6也能结合吗，会不会由于
His6带有正电，两个His6-tag的protein之间相互排斥没有结合。 |
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c********b
发帖数: 363 | 3 不知道大家是怎么纯化抗体的，挂IgG的proein A柱子得到的肯定不纯。
如果是用antigen－affinity purification就会好很多。只是有时候那个his－tag还是
会干扰。一个师兄教我先用一个带HIS6的无关蛋白把non-specific的先去掉（比如
sunnyday最喜欢的actin就被我加了his6来干这事），然后再来做antigen－affinity。
如果是intein－tag提出来的这一步都可以省掉，只是intein得到的蛋白量好像没有his
－tag提出来的多。
要提到的是这个protocol在我手上得到的抗体浓度很低，我一般用1：100稀释，但是很
特异。还有就是不太适用于IP。
这个方法不用挂柱子，跑SDS－PAGE，直接转到膜上，block之后先把血清和actin－
his6（in my case）的膜放2hr，然后上清拿出来和block过的antigen的膜泡2hr，
Wash with 1XTBS（contains 0.02％ sodium azide) twice, 10 min each，Elute
with glycine（pH3）... 阅读全帖 |
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c********b
发帖数: 363 | 4 不知道大家是怎么纯化抗体的，挂IgG的proein A柱子得到的肯定不纯。
如果是用antigen－affinity purification就会好很多。只是有时候那个his－tag还是
会干扰。一个师兄教我先用一个带HIS6的无关蛋白把non-specific的先去掉（比如
sunnyday最喜欢的actin就被我加了his6来干这事），然后再来做antigen－affinity。
如果是intein－tag提出来的这一步都可以省掉，只是intein得到的蛋白量好像没有his
－tag提出来的多。
要提到的是这个protocol在我手上得到的抗体浓度很低，我一般用1：100稀释，但是很
特异。还有就是不太适用于IP。
这个方法不用挂柱子，跑SDS－PAGE，直接转到膜上，block之后先把血清和actin－
his6（in my case）的膜放2hr，然后上清拿出来和block过的antigen的膜泡2hr，
Wash with 1XTBS（contains 0.02％ sodium azide) twice, 10 min each，Elute
with glycine（pH3）... 阅读全帖 |
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g*********3
发帖数: 177 | 5 最近做了一个蛋白的transient transfection，在HepG2中表达的，有两个标签His6,
Flag.
用His6做，通过和Negative (untranfected cell)比对，还能找到表达的特异性条带。
用了Sigma的Flag M2 mouse做，保守估计几十条带。。。
不是说sigma的M2很好用吗，做了几次都这样。
大家能否推荐个好用点的Flag抗体，不介意flag-HRP conjugated的。
谢谢！ |
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l*****k
发帖数: 587 | 6 how about do southern to get physical restriction map(if you have probe for the
gene you want?)
Actually the question you asked is weird, to me :)
if you want to do funsion construct for expression, should you use cDNA??? why
you bother to go after BAC, I think they are all genomic DNA
for expression, the best system I ever used is the PET30(a,b,c) system, all my
proteins got very strong expression, HIS6 helps to purify protein using Ni+
column, thrombin can be used to remove the fursion part fr |
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w******e
发帖数: 1187 | 7 请教：用cell-free expression synthesize peptide/protein, 要求newly synthe-
sized peptide/protein自动被immobilize到beads上，并达到尽量高的copy number。
最直接的方法大概是在gene里加个FLAG/HA的sequence，beads上coat FLAG/HA
antibody。但Ab个头太大担心copy number上不去。
请教有什么alternative method？比如his6-peptide的coverage会不会更高？
比如有没有site-specific biotinylation的reagent可以跟cell-free expression
合用？
非常感谢！ |
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p****p
发帖数: 3360 | 8 问题是如果his6的结论说明C末端是被包埋的，那么GST剪切不来的风险也不小啊。
除非linker加长。
么？ |
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b******y
发帖数: 627 | 9 3 His is not close to be enough for purification. At least 6 His. If you can
, 8 or 10.
5' long primer containing: overhang sequence (e.g. GGAA); cloning site (make
sure in frame); His6 ---5' of your gene, should be the way to go as
abovementioned. |
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s******9
发帖数: 283 | 10 没见过imidazole降解蛋白。要排除在细胞内就降解了（或者修饰变大了），或者抗体
有问题。 |
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g*********3
发帖数: 177 | 11 谢谢。网上说的倒不是imidazole会降解蛋白，而是imidazole在高温和SDS-LB煮的时候
会降解蛋白。问了周围的人，他们一般都dialysis。不知道synbio79有没有啥好推荐的
dialysis kit。
谢谢。 |
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c********b
发帖数: 363 | 13 一般都会有些污染吧，没可能是非常纯的。只要目标蛋白足够富集就好了 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 14 do you use the miniprep one? |
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i***l
发帖数: 1656 | 15 in your case,
1. target protein is degraded before chromatography
or
2. 6his affinity chromatography can not purify it well
dialysis does not help in both
to determine if #1==TRUE, western blot using target specific antibody
to improve #2, add one more chromatography (ion exchange, size exclusion,
etc) |
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g*********3
发帖数: 177 | 16 yes. Any problem with this kit? |
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g*********3
发帖数: 177 | 17 Thanks a lot.The problem is we don't have antibody for the protein.I am
using the second tag to tandem purify it and will see. |
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B***v
发帖数: 113 | 18 你把合成的peptide挂到beads上，比如通过His6，然后pull down你的蛋白，再检测多
简单。MS定量很差，通常你样本里10倍的差别，MS能看到2倍，样本2倍的差别MS就看不
到了。MS最好的用途是identify, 不是quantify。
而且你想跑两次MS, 但严格来讲两次MS结果就不可比，因为离子化效率就不一样。这也
是为什么SILAC要把样品混合的原因。
display就别想了，你自己把系统建立起来就2年过去了，而且那个是几千几万的筛选。
MS |
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K******S
发帖数: 10109 | 19 it's amazing to see how little biologists know about mass spec
：你把合成的peptide挂到beads上，比如通过His6，然后pull down你的蛋白，再检测多
：简单。MS定量很差，通常你样本里10倍的差别，MS能看到2倍，样本2倍的差别MS就看
不到了。MS最好的用途是identify, 不是quantify。 |
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