由买买提看人间百态

topics

全部话题 - 话题: homodimer
1 (共1页)
c**i
发帖数: 265
1
来自主题: Biology版 - 请教一个关于homodimer的问题
我做了一个A和B的fusion protein。A本身可以形成homodimers,在一定刺激下可以形
成oligomers。原本设计是利用A的oligomerize来激活B蛋白,但实验发现B蛋白在非诱
导下也有一定的激活(由于homodimers),但在刺激下活性加强。
现在使用的是一个GGGSGGGS的flexible linker,请问大家有没有可能通过使用rigid
linker来分开B蛋白,使得即使A形成homodimers,B也由于不可自由移动而无法
dimerize。在刺激下,B则和cluster中的其他B蛋白dimer而达到减少背景的目的。
谢谢大家了。
j*****y
发帖数: 94
2
来自主题: Biology版 - need help_how to disrupt a homodimer?
我的蛋白是个homodimer,蛋白的结晶已经作出来了。dimer interface is formed by
3 helixes from each
protomer,但是两个protomer 不是像手掌对手掌那样的完全对称interact, 而是两个
protomer之间交叉对称 ,i have
tried a bunch of single-site, double and quadruple mutations to try to
disrupt the dimer but failed. 因为
protomer不是整个helix在interact, 而是有一定角度的,所以不知道为什么两个
protomer之间的作用力会这么强。我们用
的是glycerol gradient sedimentation analysis 来确定 s value, 我试过用没有
salt 的 gradient, 结果蛋白变成了
tetramer; 在高浓度salt gradient 下,仍然是dimer.
我曾经想过能不能在helix 和 helix 之间的loop 那儿插入一小段peptide
m*******y
发帖数: 13
3
也用了analytical gel filtration,但是homodimer太大,bing的蛋白太小,所以无法
区别是bind一个还是两个都bind.
j*****y
发帖数: 94
4
谢谢楼上的。
我的这个蛋白WT和active-site mutant都是homo-dimer,这样的两个载体co-express能
得到heterodimer吗?会不会只能得两种homodimer?还是两种homodimer加上
heterodimer(minor species)?
s******y
发帖数: 28562
5
这个应该也可以。但是我担心protein A or G 的binding domain 有人
单独用过么?就是不包含其他序列,光用那个binding domain,能和Fc 里面的
单独的motif结合么?
GST蛋白不行。太大,而且GST 会导致转录出来的蛋白直接就成了homodimer 了。
其实,我刚才想了一下,发现不能用dimerization domain, 因为一旦成了
homodimer 就麻烦了,最好还是heterodimer, 象你说的那个Protein G + Fc domain
W*********e
发帖数: 247
6
来自主题: Biology版 - need help_how to disrupt a homodimer?
交叉对称是啥意思, e.g., alpha1和alpha1'有作用?

by
j*****y
发帖数: 94
7
来自主题: Biology版 - need help_how to disrupt a homodimer?
不好意思还是没说清楚,我把图片帖上来吧。
W*********e
发帖数: 247
8
来自主题: Biology版 - need help_how to disrupt a homodimer?
能问下你们的突变是怎么做的, 都是变成Ala? 可以把有相互作用的一对碱基的侧链都
突变成Asp或者Glu试试.
j*****y
发帖数: 94
9
来自主题: Biology版 - need help_how to disrupt a homodimer?
是都变成ala的。
你的意思是突变成positively charged or negatively charged 让他们相互排斥?
W*********e
发帖数: 247
10
来自主题: Biology版 - need help_how to disrupt a homodimer?
yep
H*g
发帖数: 2333
11
来自主题: Biology版 - need help_how to disrupt a homodimer?
Will this change the monomer structure or affect protein folding?
W*********e
发帖数: 247
12
来自主题: Biology版 - need help_how to disrupt a homodimer?
If the residue only mediates intermolecular interaction, and changing it to
Ala doesn't not affect monomer structure/folding, I don't see why mutating
it to an acidic residue would affect these aspects.
s********n
发帖数: 2939
13
来自主题: Biology版 - need help_how to disrupt a homodimer?
Sometimes changing residues to charge ones might affect the structure.
However, it is worth trying if you don't have any alternative method.
m*******y
发帖数: 13
14
已经try了ITC,但是出来的数据不好,不可用。
不知道还有什么方法可行,fluorescence可行么?
谢谢!
w******e
发帖数: 1187
T**********t
发帖数: 1604
16
试试analytical ultracentrifugation?
m**z
发帖数: 787
p****s
发帖数: 3153
g*********5
发帖数: 2533
y******8
发帖数: 1764
20
If you can measure the complex formation in real-time, then very easy.
If not, too many artifacts could compromise your conclusion.
S*****s
发帖数: 287
21
Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Apr 14;106(15):6369-74. Epub 2009 Apr 1.
Structural rearrangement of CaMKIIalpha catalytic domains encodes activation.
Thaler C, Koushik SV, Puhl HL 3rd, Blank PS, Vogel SS.
看看这篇文章吧。作者用 two photon imagine 做 homoFRET 看 CaMKII 单体怎么样组
合成一个 enzyme complex。我觉得这个技术应该能解决你的问题。
z*t
发帖数: 863
22
Beutler得奖,Medzhitov会不会有意见?
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1074761309002
Ruslan Medzhitov
This year marks the 20th anniversary of a publication (Janeway, 1989) that
in many ways revolutionized our understanding of the immune system. As part
of the proceedings of the Cold Spring Harbor Symposium on Immune Recognition
, the paper authored by the late Charles A. Janeway, Jr. was not a standard
peer-reviewed publication. In fact, Charlie used to refer to it as “the
best paper I've ... 阅读全帖
x*****y
发帖数: 118
23
来自主题: Biology版 - 问个蛋白的实验问题
现在有个20kD的蛋白怀疑在小分子ligand 作用下形成homodimer. 有晶体结构
这个蛋白没有ligand 的话是monomer
请问怎么确定在溶液里也是dimer?
试过 size-exclusion column, NMR, ITC. 结果都不明确
l****y
发帖数: 398
24
来自主题: Biology版 - 问个蛋白的实验问题
增加蛋白和ligand浓度,降温,减少溶液离子强度
[在 xdrfvgy (xc) 的大作中提到:]
:现在有个20kD的蛋白怀疑在小分子ligand 作用下形成homodimer. 有晶体结构
:这个蛋白没有ligand 的话是monomer
:...........
1 (共1页)