c**i
发帖数: 265 | 1 我做了一个A和B的fusion protein。A本身可以形成homodimers，在一定刺激下可以形
成oligomers。原本设计是利用A的oligomerize来激活B蛋白，但实验发现B蛋白在非诱
导下也有一定的激活（由于homodimers），但在刺激下活性加强。
现在使用的是一个GGGSGGGS的flexible linker，请问大家有没有可能通过使用rigid
linker来分开B蛋白，使得即使A形成homodimers，B也由于不可自由移动而无法
dimerize。在刺激下，B则和cluster中的其他B蛋白dimer而达到减少背景的目的。
谢谢大家了。 |
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j*****y
发帖数: 94 | 2 我的蛋白是个homodimer，蛋白的结晶已经作出来了。dimer interface is formed by
3 helixes from each
protomer，但是两个protomer 不是像手掌对手掌那样的完全对称interact, 而是两个
protomer之间交叉对称 ，i have
tried a bunch of single-site, double and quadruple mutations to try to
disrupt the dimer but failed. 因为
protomer不是整个helix在interact, 而是有一定角度的，所以不知道为什么两个
protomer之间的作用力会这么强。我们用
的是glycerol gradient sedimentation analysis 来确定 s value， 我试过用没有
salt 的 gradient, 结果蛋白变成了
tetramer; 在高浓度salt gradient 下，仍然是dimer.
我曾经想过能不能在helix 和 helix 之间的loop 那儿插入一小段peptide |
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m*******y
发帖数: 13 | 3 也用了analytical gel filtration,但是homodimer太大，bing的蛋白太小，所以无法
区别是bind一个还是两个都bind. |
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j*****y
发帖数: 94 | 4 谢谢楼上的。
我的这个蛋白WT和active-site mutant都是homo-dimer，这样的两个载体co-express能
得到heterodimer吗？会不会只能得两种homodimer？还是两种homodimer加上
heterodimer（minor species)? |
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s******y
发帖数: 28562 | 5 这个应该也可以。但是我担心protein A or G 的binding domain 有人
单独用过么？就是不包含其他序列，光用那个binding domain，能和Fc 里面的
单独的motif结合么？
GST蛋白不行。太大，而且GST 会导致转录出来的蛋白直接就成了homodimer 了。
其实，我刚才想了一下，发现不能用dimerization domain, 因为一旦成了
homodimer 就麻烦了，最好还是heterodimer, 象你说的那个Protein G + Fc domain |
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W*********e
发帖数: 247 | 6 交叉对称是啥意思, e.g., alpha1和alpha1'有作用?
by |
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W*********e
发帖数: 247 | 8 能问下你们的突变是怎么做的, 都是变成Ala? 可以把有相互作用的一对碱基的侧链都
突变成Asp或者Glu试试. |
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j*****y
发帖数: 94 | 9 是都变成ala的。
你的意思是突变成positively charged or negatively charged 让他们相互排斥？ |
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H*g
发帖数: 2333 | 11 Will this change the monomer structure or affect protein folding? |
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W*********e
发帖数: 247 | 12 If the residue only mediates intermolecular interaction, and changing it to
Ala doesn't not affect monomer structure/folding, I don't see why mutating
it to an acidic residue would affect these aspects. |
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s********n
发帖数: 2939 | 13 Sometimes changing residues to charge ones might affect the structure.
However, it is worth trying if you don't have any alternative method. |
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m*******y
发帖数: 13 | 14 已经try了ITC,但是出来的数据不好，不可用。
不知道还有什么方法可行，fluorescence可行么？
谢谢！ |
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T**********t
发帖数: 1604 | 16 试试analytical ultracentrifugation? |
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y******8
发帖数: 1764 | 20 If you can measure the complex formation in real-time, then very easy.
If not, too many artifacts could compromise your conclusion. |
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S*****s
发帖数: 287 | 21 Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Apr 14;106(15):6369-74. Epub 2009 Apr 1.
Structural rearrangement of CaMKIIalpha catalytic domains encodes activation.
Thaler C, Koushik SV, Puhl HL 3rd, Blank PS, Vogel SS.
看看这篇文章吧。作者用 two photon imagine 做 homoFRET 看 CaMKII 单体怎么样组
合成一个 enzyme complex。我觉得这个技术应该能解决你的问题。 |
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z*t
发帖数: 863 | 22 Beutler得奖，Medzhitov会不会有意见？
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1074761309002
Ruslan Medzhitov
This year marks the 20th anniversary of a publication (Janeway, 1989) that
in many ways revolutionized our understanding of the immune system. As part
of the proceedings of the Cold Spring Harbor Symposium on Immune Recognition
, the paper authored by the late Charles A. Janeway, Jr. was not a standard
peer-reviewed publication. In fact, Charlie used to refer to it as “the
best paper I've ... 阅读全帖 |
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x*****y
发帖数: 118 | 23 现在有个20kD的蛋白怀疑在小分子ligand 作用下形成homodimer. 有晶体结构
这个蛋白没有ligand 的话是monomer
请问怎么确定在溶液里也是dimer?
试过 size-exclusion column, NMR, ITC. 结果都不明确 |
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l****y
发帖数: 398 | 24 增加蛋白和ligand浓度，降温，减少溶液离子强度
[在 xdrfvgy (xc) 的大作中提到：]
：现在有个20kD的蛋白怀疑在小分子ligand 作用下形成homodimer. 有晶体结构
：这个蛋白没有ligand 的话是monomer
：........... |
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