m******p
发帖数: 67 | 1 I have genomic DNA samples of about 1000 diabetic patients. We are
interested in examining the sequence variations of a gene in these samples.
But we are not good at this and have 2 questions.
1) Can we do that by traditional Sanger sequencing? This is very doable.
We first PCR the fragment of interest, and then do sequencing. But the
problem is that Sanger sequencing cannot distinguish paternal and maternal
alleles, that is, we cannot tell whether a variation is homozygous or
heterozygous, u... 阅读全帖 |
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s*****3
发帖数: 20 | 2 Here are my 2 cents.
1) If you only look at one or a few SNP(s) for that gene, Taqman SNP
analysis (in 384-well or even in 96-well format) can be your choice. This is
much
cheaper and faster than Sanger or NGS.
2) If you look at 10-100 SNPs, Openarray SNP analysis (using OpenArray or
Quantstudio) can be your choice.
3) If you look at a large number of SNPs, e.g >100 SNPS (though I doubt it
since you only look at one gene), you could consider NGS target resequencing
such as Ion Torrent custom Am... 阅读全帖 |
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m**********2
发帖数: 2646 | 3 You can use the Seqscape software (by applied biosystem I think). You can
put in all the exon information of this gene and import all the sanger
sequencing files at the same time. It will detect the SNPs right away (you
can set the threshhold, for example,call any mutation that is at 25% of the
WT in peak size).
After they made the SNP calls, you can click on each SNP to look at the peak
and determine whether it is homozygous or heterozygous.
The software cost about $4000~6000, but it has a 30-d... 阅读全帖 |
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s******s
发帖数: 13035 | 4 不过取代不容易。siRNA有点像hemizygous,
CRISPR现阶段只能homozygous。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 6 两回事。crisper可以做homozygous mutant，也就是knockout；
RNAi这玩意儿更像hetreozygous mutation，knockdown |
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f******t
发帖数: 2699 | 7 现在看不了paper，不好说。
挺意外的，他们这两个新mutant什么background？我印象中原来的null是ws2的
background，homozygous lethal。这两个新的是col0吗？也许是background的差异？
这差异倒是太大了点儿。
这两个line都是在非常靠前的位置突变的，paper有结果证明没有另外的ATG可以用来
编码一个partial protein么？
如果这个新结果站的住脚的话，那么前几年的几篇CNS的结果就都要打问号了。当
然，也不算太意外，Friml实验室的结果。。。
or
hypothesis
generated
approaches
two |
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f******t
发帖数: 2699 | 8
另一个有 off-target嫌疑的技术？没有证据表明，abp1-c1 是否影响到其它target，
尽管回交了一下；然后，他们也提到可能有紧密连锁的其它突变（off-target所致）无
法清掉，所以就筛了另一个（非Cas）突变abp1-TD1。乖乖，也没有表型，但是同样无
法证明abp1-TD1影响了其它基因。反正，两种可能都有：以前的结果被他们认为是off-
target造成，别人也可以说，你们现在的结果也没法排除这个可能性，那发出来干嘛？
等以后第三方再来“纠正”？就为了数文章数？本来，他们吧 abp1-c1 和abp1-TD1杂
交的F1 表型验证一下，对于排除可能的off-target也稍微更有说服力一些（如果这些
影响是隐性的）。
－－验证负结果跟正结果不一样。至少他们证明了基因不表达（我对此存疑），但植物
没有表型。off target导致负负得正的机会有多大呢？他们至少做了abp1-c1跟WT回交
clear background。我赞同你的观点，他们确实应该做几个complement，abp1-c1Xabp1
-TD1是一个，另一是cross最早的那个embry... 阅读全帖 |
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m*******3
发帖数: 25 | 9 刘春明在JIPB上发表的对APB1的commentary
http://www.jipb.net/pubsoft/content/2/10.1111/jipb.12339.pdf
Science is a global community enterprise. Collectively, we contribute to
building the
knowledge tower by using bricks and mortar that should be strong, solid, and
long
lasting. A brick with defects may lead this tower, or a part there of, to
collapse. When
that happens, the community suffers, laying waste countless dedicated hours
of work,
especially by students and postdoctoral scholars. This is the reason... 阅读全帖 |
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k********n
发帖数: 756 | 10 如果顾虑HETEROZYGOUS KNOCK-IN会导致整个动物因为神经功能问题不能繁殖，
HOMOZYGOUS肯定会死，整体设计思路应该是怎样？CONDITIONAL KNOCK-IN? |
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l****y
发帖数: 486 | 11 Assume your knock-in here refers to mutating a site at the endogenous locus
(thus over expression-type approach, such as making transgenic mouse from
Rosa26 locus, will not be applied here).
Then the question is: you expect your mutation is a gain-of-function
mutation or loss-of-function mutation.
If your mutation is GOF mutation, it is easy, see Kras V12 KI strategy--
basically insert stopper element LSL before Kras V12 Exon. Note that the
allele LSL Kras V12 (before crossing with Cre) is a nul... 阅读全帖 |
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g**********y
发帖数: 423 | 12 Below are two SNPs I obtained for two samples from Exom DNAseq and Sanger.
From Sanger's results, it seems both SNPs are heterozygous, while GATK(v3.2)
call one sample as homozygous.
Does this mean we still need to do filtering based on sequencing depth,
which is hard filtering, then why do we need the machine learning-based soft
filtering?
If we need to do filtering based on sequencing depth, what threshold would
you recommend?
Sample1:GATK Sample2:GATK Sanger for both samples Sample1:IGV Sampl... 阅读全帖 |
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o**4
发帖数: 35028 | 13 我的donar上没有筛选标志，也想用crispr跟ssODN做knockin，按照你说的效率极低，
heterozygous的效率都只有千分之一，那homozygous是不是没戏了？
要是你会挑多少克隆试试呢？
非常感谢。 |
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C****n
发帖数: 79 | 14 你筛了多少个突变子？遇到过三个allele 同样的突变吗？也就是Homozygous的情况。 |
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f********e
发帖数: 15 | 15 筛了四五十个，只有一个发生同源重组的是三个同样的突变，其他的突变体都是
heterozygous。我的问题在于，我不只是想把基因全本KO，还想研究基因的dosage效应
，所以还想要筛到只敲掉一个或者两个allele的突变体，难啊。
以前在euploid细胞里做突变的时候，倒是看到一些两个allele一样的突变，但是现在
变成三个allele，indel mutation就没有看到homozygous的情况了，可能allele太多了
吧，呵呵。 |
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f********e
发帖数: 15 | 16 最大的可能就是发生了同源重组吧 ：一条链先发生indel mutation，然后另外一条链
以这个突变的链为模版进行同源重组，然后就是homozygous了。 |
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发帖数: 1 | 17 在做人的干细胞基因组编辑的时候，由于效率非常的低，我试了一下同时给细胞提供两
个模板质粒，分别带有不同的颜色，比如绿色和红色，然后用guideRNA和Cas9引入双链
断裂，通过同源重组，两份模板分别进入两个allelle，这样通过流式细胞筛选理论上
就能得到homozygous编辑了的细胞。大家觉得这个idea能够发一篇什么样的文章？为了
排除模板质粒的随机整合，我打算在质粒的骨架上引入一个蓝色荧光蛋白，那么每次我
做流式细胞筛选的时候，可以排除掉带有蓝色光的细胞，而只收集带有红光和绿光的细
胞。欢迎大家给点建议，我觉得由于在实际操作过程中，让细胞进行了多次的荧光紫外
线照射，富集细胞的时候照三次，然后在移除筛选荧光而只留下所想要的突变的时候，
还要做一次筛选，又要进行两次荧光照射，感觉这样得到的细胞，质量不可控。 |
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发帖数: 1 | 18 你们是在什么细胞系里边做的呢？
这个筛选标签是可以去除的，比如在两侧加入TTAA和piggyBac的ITR，得到这种带有标
签的细胞之后，过表达piggyBac的转座酶，就能够去除掉不留下任何的痕迹。这个是没
有问题的。
通过这种方法我已经拿到了isogenic人干细胞系，表型也已经找到。现在我在博三，还
有一年半的时间，我想来试试这个combination不同荧光，如果我同时需要导入多个基
因的突变，如果针对每个基因设计的模板都带有不同的荧光，那么我最后只需要用流式
细胞筛选，直接筛到几个点同时突变的细胞系，按理说应该是非常有用的。前一段时间
，日本和荷兰的两个实验室同时在人的肠上皮细胞系中导入四个或者五个突变去模拟
Colorectal Cancer，以验证之前所发现的跟这种癌相关的基因突变究竟怎么导致癌变。
homozygous |
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发帖数: 1 | 19 你说的这个TALEN所用的双色系统跟我所说的不是一回事吧，我又去查了一遍，没有人
使用过两种荧光来一步筛选homozygous细胞的啊。
能不能给我指点一下是哪一篇文献呢？ |
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发帖数: 1 | 20 allele: one of a number of alternative forms of the same genetic locus (from
wiki)
人是diploid，所以对于每一个人来说，每一个genetic locus上都有两个allele（XY除
外）。
allele是对于haploid genome来说的，对于人来说称作genotype更合适，例如AA Aa/aA
aa是三种genotype。楼主说的检测不同allele，我的猜测是检测携带homozygous AA/
aa genotype（而非allele）的细胞，因为细胞不可能是单倍体（除生殖细胞）。
SNP不止存在AT和GC变换，可以从ATGC中的任何一个变到ATGC中的任何另一个，有
transition和transversion的区别。
一个allele，可能存在多个snp吗？
这里概念搞错了。SNP是指一个位点上在群体里有不同的allele，比如你带AA，我带Aa
。而allele指的是A或a。
如果你的问题是，一个SNP，可能存在多个allele吗？当然可能，有tri-allelic的SNP
的... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 21 最近genotype一个cancer cell line（neuroblastoma）的microsatellite （tandem
repeat）位点
大概三个月前测的是这个位点是homozygous有6个repeat
然后最近重新解冻另外一个stock，start cell culture，测量同样的位点，居然成了
heterozygous，一半仍然6个repeat，另外一半成了10个repeat；反复做了很多遍，换
了所有的reagent生怕是contamination，但结果还是一样。
问了lab technitian，这个neuroblastoma在我们实验室都是一样的来源，他也怀疑这
个repeat是不是dynamics的
三个月前的cell line的passage不记得了
最近这个cell line的passage大概是p10
我想问下，cancer cell line的genome microsatellite难道真的会传代传着传着就发
生了变化？如此不稳定？ |
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发帖数: 1 | 22 我倒不那么认为，我不觉得作者会那么low。问题是人家就那么随随便便一测就能发现
如此多的随机突变，这个从概率上来说，已经可以说明问题了。不要因为不喜欢别人的
结果而坚持要推翻别人的结论。
在supplementary的数据中写道：FVB/NJ mice, which are inbred and homozygous
for the retinal degeneration 1 (rd1) allele of Pde6b, were purchased from
The Jackson Laboratory, (Bar Harbor, ME). Co-housed FVB/NJ mice without
CRISPR-mediated correction were used as the functional-deficient control.
Briefly, an sgRNA- expressing plasmid had been coinjected, into FVB/NJ
zygotes, with the single-stranded oligodeoxynucle... 阅读全帖 |
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x****n
发帖数: 893 | 23 Serum test theta has a reference interval from 0 to 5 mg/dL. Changing the
reference interval to 0 to 10 mg/dL would do which of the following?
A. Increase the specificity
B. Increase the sensitivity
C. Increase the number of false-negative results
D. Decrease the number of false-positive results
E. Not alter the sensitivity or specificity
正确是B。
我的理解是，如果reference interval被扩大了，说明会有更多的超出本来的正常范围
的数值被当做正常，比如8，原来是超出范围的，现在会被认为是在reference
interval之内。所以会有更多的假阴性。我选了C。
第二题：
An African-American couple with ... 阅读全帖 |
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