c********n
发帖数: 225 | 1 第五篇 Tag! You’re it.
这篇回顾一下用His-tag纯化蛋白带来的一些花絮。
每个蛋白都有自己的脾气，所以表达和纯化他们其实就有点像cooking，从原材料的准
备，配方到调味，把握火候，最后色香味俱全才可能成为一道佳肴 – 对于蛋白就是要
达到有其对应的生物活性了。每每看到“保证型”蛋白表达服务的宣传，心里笑一下，
然后就会想到自己的一个“秘密武器” – 有一个融合蛋白确实可以达到几乎100%的高
效表达， 只是都在包涵体里。从另一方面来讲，如果没有时间和经费的限制，确实每
一个蛋白只要花功夫去做，最后都能达到100%成功率,得到有生物活性的终产物。
大部分人的时间和经费都有限，也不是每一个人都有耐心或有必要成为大厨， 那么就
有了purification tag。 His-tag是个经典。说起Histidine这个氨基酸，它的
imidazole side chain的pKa在6左右，这个特性让Histidine成为很多酶的活性中心的
一个重要组分， 这方面这次就不多讲了；另一方面，histidine也是个很好的metal
chelator， 是很多metallop... 阅读全帖 |
|
p****s
发帖数: 3153 | 2 好像也可以做的，不一定会被交换掉。对于常用的HSQC来说，是从H开始到N然后再到H，靠的是J-
coupling，而一开始的信号来自amide上的H，amide上的H可以和水交换。如果交换速度
太快，这个H就观测不到了。不过看起来如果有氢键（二级结构）存在的话，交换速度会慢很多。别
的常用的3D NMR方法都是建立在HSQC的基础上。你可以看看下面的文章，一个49kD的蛋白（寡聚），
在80C条件下做的。
http://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/ja1064608 |
|
p****s
发帖数: 3153 | 3 1. 没看文章不清楚，我觉得应该是大部分样品都是D,13C和15N标记
2. 纯化过程是用普通水，表达过程中用重水
3. 不需要，都是蛋白呀，C和N在蛋白里是稳定的原子，不会和别的发生交换。amide H
(D)和OH的
H(D)可以与水中的H交换，这也是D代蛋白里HSQC的H信号的来源
4. 不知道需要多少时间，取决于你的谱的质量，你可以先用D和15N标记看看HSQC的谱
怎么样。或者不
用D先看看。如果峰特窄的话就有往下面做的意义，不过我觉得基本没什么问题。其实
我没做过
solution NMR解谱...一般的蛋白从得到谱算一个月怎么样都能解出来了。不过你的蛋
白太大，我估
计可能要用一些4D的方法吧。
C12 |
|
m**z
发帖数: 787 | 4 1. 如果另一个蛋白你有很多的话，不妨先用现有的不是很纯的蛋白试试看HSQC.如果那
些是杂蛋白，不应该影响你的HSQC吧？（assuming the other protein is N15-
labeled) |
|
b******y
发帖数: 627 | 5 A protein of a few hundred amino acid residuals is sort of on the upper side
of NMR studies. Only hard core NMR labs should do it.
Just give you a bit info. You need to label the protein with N15 and C13 in
D2O given its size. Assign all the amide peaks on a 2-D HSQC or HMQC (again
hundreds of them, of course). Then take a series of 2-D HSQC or HMQC with
increasing concentrations of the ligand. Presumably the amide close to the
ligand will change and those far away remain unaltered. As such, you... 阅读全帖 |
|
f*****e
发帖数: 19 | 6 楼主那几百个氨基酸会死人的...而且assign每个峰时间也很长啊...
话说可以简单看看有没有可能结合一些特异的氨基酸,比如trp, gly神马的,在N15-HSQC
的谱上很明显,可以缩小范围,呵呵
有米的话还可以标记特殊的氨基酸,分别表达蛋白,然后做HSQC,挨个试...
side
in
again |
|
g**********n
发帖数: 4 | 7 工作描述如下， 本人的背景跟这个位置非常match，简历基本cover所有discription，
已经在线投简历，还请有关前辈多多指点，帮忙再push一下简历给Hiring Manager就太
好了！先谢了.
（在线简历是个德文网站，还要browser翻译成英文，最离谱的是还提示要用“原始语
言”投简历，以便recruiter筛选，算是奇葩经历了）
Job Description A health care company with global reach. A product pipeline
filled to the brim. A team committed to scientific advancement. Think what's
possible. Novartis and its associated companies are always looking for
talented employees globally. We are engaged in advance preparation for
potential position openings.... 阅读全帖 |
|
l*******e
发帖数: 214 | 8 我有两个样品,因为标记的关系分子量只差500不到：
1.Uniformly 15N,13C labeled Ubiquitin T66C in 50 mM phosphate buffer, pH6.5,
加了一个paramagnetic DOTA-M8 tag 到C66上, 用900 MHz NMR (ipap)得到了一组 HN
RDC值.我目前只看其中三个residue的值: K33,K27,K29.
2.15N-lys labeled Ubiquitin T66C (7 Lys residues) in 50 mM phosphate buffer,
pH6.5, 也加了一个paramagnetic DOTA-M8 tag 到C66上,用900MHz (ipap) 和 600MHz
(coupled HSQC) NMR分别得到了一组RDC值.也只看其中三个residue的值: K33,K27,
K29. 结果这两组不同场强下的RDC值找不到正比于磁场强度的平方关系, 尤其residue
K27 差得相当大.
当我对比样品一和样品二时，同在900MHz下的RDC值也不相同，也是K2 |
|
p****s
发帖数: 3153 | 9 coherence relaxation我不了解，inept是在H和N之间建立correlation的方法，在这种
谱上每个峰对应一个amide，除了proline(因为N上没有H）。强度和弛豫时间有关，跟
结构也许关系不大，位置可以决定chemical shifts，通过chemical shifts可以了解二
级结构，但前提是你能做assignment，一般不可能通过一个谱就做assignment。
你不理解是因为你不知道NMR的基础么? 我觉得从表面上知道怎么回事可能短时间就够
了，大家都能做HSQC不是，哈哈。但是要真正懂没有几个月是不可能的。 |
|
m**z
发帖数: 787 | 10 The Val in your peptide won't get oxidized... Argon is for anaerobic purpose
. But since your peptide doesn't have Cys, don't think it is necessary. Don'
t know about your question 2... They didn't sterile as what I can tell from
their description.
For NMR, it should be easy to check your sample. Run a simple HSQC at the
end of your experiment to compare with the spectrum taken at the beginning.
This should give you a pretty good idea of your sample integrity.A little
precipitation during NMR ma... 阅读全帖 |
|
c*****e
发帖数: 436 | 11 Argon for anaerobic purpose is not for sterilization? then for what?
oxidization? which residue?
Thanks for the HSQC suggestion, though I'm not able to do this now I'll
consider.
purpose
Don'
from
. |
|
m**z
发帖数: 787 | 12 NMR没有多少峰的原因很多吧，比如蛋白太大或者多聚,multiple conformational
state等等。。 反正我之前作的一个蛋白，肯定fold是没有问题的（nice alpha-
helical structure by CD and even crystal structure)，NMR出来就是没有几个峰。
我觉得不能用这个来推断没有folding.
相反，没有folding的蛋白据我理解应该有很多峰，只不过这些峰不disperse,全部集中
在HSQC中间的地方，这个好像是没有folding的一个特征。
CD应该是相对容易得看蛋白有没有folding得不错的方法 |
|
C*********m
发帖数: 213 | 13
15N HSQC 没有多少峰？那 一维氢谱的methyl区呢？ |
|
m**z
发帖数: 787 | 14 做结构的lab... NMR的确不一定每个蛋白都能做的。。。可以试试看不同的buffer条件
，包括pH,盐浓度等。我知道NMR对于这些条件的容忍度不是很高，不过还是可以一试。
还有就是你的HSQC是什么温度run的呢？如果只是25度的话，试试看提高温度到35甚至
40度，也许能有好一点的谱也不一定（当然你的蛋白要够稳定。。。）
我不是做结构的，不过我以前一个蛋白也试过NMR,那个时候晶体结构已经有了。25度的
时候也是只有几个peak,40度的时候好很多。后来发现蛋白会形成tetramer.可能提高温
度有利于某一种state,所以能看到不少峰。我们认为应该就是这个tetramer...这样的
话就是一个45kDa的分子。后来有人还试过full deuteration.谱又好了很多，不过还是
不ideal...现在不知道还有没有人再努力。。。所以我觉得有时候NMR条件的优化是得
益于你对这个蛋白性质的了解得。
或者能不能同时也试试看crystal呢？也许能多一点机会。 |
|
m********r
发帖数: 124 | 15 版上牛人多，上次的菌落PCR感谢各位已经解决，现在有个新蛋白纯化的问题，快半年
了始终没解决，特上来求救：
是一个粘菌中的小蛋白13KD左右，遗传学认为在信号通路里起抑制作用。表达用His-
GB1-tag大约50%可溶。GST差不多的样子。GB1的表达量大很多。可是纯化总是有问题，
在100%的buffer B （300mM咪唑）下来，总是还有很多别的杂蛋白，这些杂蛋白似乎洗
不干净。过个Gel filtration 也分不开。
这个蛋白确实知道的很少，BLAST就出来10个左右，第三个e-value已经是1.5了。我怀
疑是降解得问题，因为去预测结构的时候，只有后面的70个氨基酸给了预测的结果，前
面都没结果，而且这段结构也是loop居多。而且纯化过程是分子量比它小的杂蛋白。但
是我加了蛋白酶抑制剂，没啥作用。
在黏菌的基因组中，它是跟另一个蛋白在一块的，我可以尝试共表达他们两个，但问题
是，我们的目的是验证这两个蛋白的相互作用，如果这样，我得到了稳定的蛋白
complex，再怎么分开他们呢？
确实很头大，眼看着这个蛋白拿不到，（另一个蛋白早就拿到了，HSQC也有了）想做的
蛋白相... 阅读全帖 |
|
m********r
发帖数: 124 | 16 1.老板也说了，但是暗示对现有project意义不大，因为我们就需要的大量的蛋白做个
相互作用的HSQC，所以暂时不主张做
2,我已经18度了，不能再低了吧
3.这个我倒听说过，防止蛋白聚集沉淀吧，可以在Ni柱的buffer里加码？ |
|
m**z
发帖数: 787 | 17 我知道NMR titration需要很高浓度。。。如果有cryo probe的话，HSQC 100uM 甚至更
低些应该也能work。你没完成的titration能不能给你些关于binding site的idea呢？
GSTtag如果work的话，多纯化几批能不能work呢？
前面你提到10-15kDa有两个杂蛋白，你的蛋白多大呀？这两个蛋白的分子量加起来和你
的蛋白比怎么样？
equivalent |
|
z***q
发帖数: 907 | 18 非常感谢你的建议！
我们实验室现在一般不用phosphate，直接用H2O+NaCl,然后pH the sample,据说得到的
谱图比较好，所以我从来没有试过加phosphate。
不过这样做可能的确有问题，pH 也不太准，我试试用5mM的phosphate，不加盐离子看
看吧
sample concentration 大约0.9-1mM.
请问这个浓度能做natural-abundance N15-HSQC么？
非常感谢！ |
|
s****l
发帖数: 395 | 19 蛋白如果容易从E.coli纯化的话, 用15N label protein，NMR看HSQC谱的变化能知道结
合区域 |
|
d******1
发帖数: 709 | 20 CD和荧光粉不用报什么希望了，太低resolusion了，不过随便做一下也可以，反正用的
量少。
如果蛋白小的话，可以做NMR看一下，一个HSQC就什么都看到了。
最后的一种可能是结晶水，你查一下在预定的第三个碱基位置上是不是有一个保守的水
分子，这个可以通过比较多个结构得到。 |
|
a****n
发帖数: 53 | 21 奇怪大家怎么没想到用
HNMR, CNMR, HSQC and HMBC啊，重要的HMBC,看看甲基的质子是和酯基阿尔法碳相关还
是和芳基阿尔法碳相关啊。
化学方法可能是
水解酯基成羧酸，一个应该有分子内氢键，另一个没有。 |
|
a****n
发帖数: 53 | 22 奇怪大家怎么没想到用
HNMR, CNMR, HSQC and HMBC啊，重要的HMBC,看看甲基的质子是和酯基阿尔法碳相关还
是和芳基阿尔法碳相关啊。
化学方法可能是
水解酯基成羧酸，一个应该有分子内氢键，另一个没有。 |
|
f*******y
发帖数: 50 | 23 CH比CH2 downfield, 比如ch2 在2.6,ch在3.0.
建议做个DEPT或者HSQC就知道CH和CH2区别了。 |
|
y*****s
发帖数: 1047 | 24 碳谱定量要么把interscan delay放很长要么掺Cr(acac)3之类的东西加快弛豫
可以尝试1H-13C HSQC 比13C NMR 灵敏很多 |
|
