c********n
发帖数: 225 | 1 实验流程第一步：
1. Cell culture
更新前
293T cells are maintained in high-glucose DMEM (HyClone) supplemented with
10% FBS (HyClone) and penicillin/streptomycin at 37°C with 5% CO2
incubation. Cells are seeded to 24-well plate (Costar) with 60% confluence 8
hours before transfection. Thirty minutes before
transfection, cells are washed twice with PBS and medium is changed to high-
glucose DMEM medium containing 2% FBS.
更新后
293T cells are maintained in high-glucose DMEM (Gibco) supplemented with 10%
FBS (Gi... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 2 你是说Hyclone 的$148/500mL？非常便宜了！怎么弄到这个价格的？
我们这里即使是Sigma 的也得１２０一瓶，Hyclone 的大概２００多。 |
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c********n
发帖数: 225 | 3 问题总结
1.实验材料来源（Hyclone vs Gibco的培养基，以及原文没有特别提到的“Biolab”T4
PNK）会影响可重复性吗？
HyClone以及其他 T4 PNK 供应商，你们是不是要想一想自己的问题在哪里了？
还有，ThermoFisher可要注意了，你们的Lipofectamine® 3000可能有问题！
2.原文用于plasmid和guides （DNA）的0.5xTE，更新后 改成NaOH调出来的pH8.0的水。
先不谈怎么来用NaOH调出这个稳定的没有缓冲液的pH8.0的水，如果原因是由于NgAgo对
于EDTA这么的敏感，那么原文中用到的大约0.015-0.025mM的EDTA，是怎么做出的NBT文
章中的结果的？
3.关于细菌污染问题。从新闻报道和照片上看，韩春雨老师他们做实验是经常不戴手套
的，看来他们这样做细菌污染机率会减少。所以这些重复NgAgo实验的人们，你们重复
NgAgo实验的时候，带手套了吗？你们的实验材料有没有被细菌污染呢？
4.看来Mg2+的浓度，在不同的cell type也需要optimize
5.看来ss gDNA 二次转染... 阅读全帖 |
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i***s
发帖数: 39120 | 4 韩春雨实验室所在的四层老楼新安装上智能门。
韩春雨论文中的关键实验环节。
韩春雨瘦了，一位接近他的人说，最近韩春雨经常做实验到凌晨两三点钟。
他的实验室在河北科技大学一座四层老楼里，红色的外墙伏满了爬墙虎，韩春雨在这一待就是10年。今年5月2日，一篇关于新基因编辑技术NgAgo的论文在国际顶级期刊《自然·生物技术》（Nature Biotechnology）在线发表（后在该刊第34册7月号纸质版发表），作者是河北科技大学副教授韩春雨领衔的课题组。发表后，不仅他个人，连他所在的实验室，都获得了前所未有的关注。为了安全，学校不得不给实验楼安装上刷卡入内的智能门，还布了摄像头。
韩春雨有两间研究室在三楼走廊的尽头。在接待过一波又一波记者，甚至有长江学者来访的房间里，一张白色纸片嵌在插座缝里，上面写着“Arrival of the Argonautes 1.0T and 2.0 Smart! （Ago1.0T和2.0Smart版本的到来！）”，后缀为两个笑脸。实验室在等NgAgo优化版2.0尽快问世。
但NgAgo1.0仍然摇摇欲坠。由于多个实验室无法重复实验，被认为可以超越时兴的CRISPR... 阅读全帖 |
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C**********e
发帖数: 23303 | 5 由此可见华人本性的丑陋
华人想保留一些技术秘密有多末难
生物界简直是一群精神病嘛
令人难以想象
看篇论文就想重复试验
真是脑子烂掉了
谁会把关键技术放在论文里？
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在韩春雨的舆论风波逐渐发酵之时，8月8日，韩春雨向非盈利性质粒共享信息库
Addgene提交新版的详细实验方法，并补充了数项应当注意的问题。
中国青年报·中青在线记者在Addgene网站中看到，新版实验方法分为细胞培养、
质粒/gDNA 共转染、基因组提取三个部分，一些实验细节与其在《自然-生命科学》中
发表的论文有所不同。
据 “科学美国人”中文版《环球科学》的微信公众号“科普圈”介绍，新实验步
骤有几处改变，其中包括“血清品牌由Hyclone 变更为Gibco”，“溶解和稀释质粒及
gDNA 的缓冲液变更为水（pH 8.0）”，“建议在质粒/gDNA共转染的8小时、12小时或
24小时后，补转一次gDNA（旧版方法中只提及了‘24小时’）”等内容。
此外，韩春雨还在新版实验方法中列出了4项注意事项，其中包括“NgAgo/gDNA 系
统对细胞中胞内菌和支原体感染敏感，在实验... 阅读全帖 |
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w*******e
发帖数: 15912 | 6 哥不懂生物，还请各位千老们给哥指点迷津
http://news.ifeng.com/a/20160810/49751762_0.shtml
论文被疑造假 韩春雨公开详细实验方法
2016年08月10日 11:29
来源：中青在线
3434人参与 240评论
原标题：韩春雨公开详细实验方法
中青在线讯（中国青年报·中青在线记者叶雨婷）在韩春雨的舆论风波逐渐发酵之时，
8月8日，韩春雨向非盈利性质粒共享信息库Addgene提交新版的详细实验方法，并补充
了数项应当注意的问题。
中国青年报·中青在线记者在Addgene网站中看到，新版实验方法分为细胞培养、质粒/
gDNA 共转染、基因组提取三个部分，一些实验细节与其在《自然-生命科学》中发表的
论文有所不同。
据“科学美国人”中文版《环球科学》的微信公众号“科普圈”介绍，新实验步骤有几
处改变，其中包括“血清品牌由Hyclone 变更为Gibco”，“溶解和稀释质粒及gDNA 的
缓冲液变更为水（pH 8.0）”，“建议在质粒/gDNA共转染的8小时、12小时或24小时后
，补转一次gDNA（旧版方法中只提及了‘24小时’）”等内容。
此外... 阅读全帖 |
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C**********e
发帖数: 23303 | 7 韩春雨终于被海外千老逼得交待了技术秘密
韩国丹麦摘桃
由此可见华人本性的丑陋
华人想保留一些技术秘密有多末难
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在韩春雨的舆论风波逐渐发酵之时，8月8日，韩春雨向非盈利性质粒共享信息库
Addgene提交新版的详细实验方法，并补充了数项应当注意的问题。
中国青年报·中青在线记者在Addgene网站中看到，新版实验方法分为细胞培养、
质粒/gDNA 共转染、基因组提取三个部分，一些实验细节与其在《自然-生命科学》中
发表的论文有所不同。
据 “科学美国人”中文版《环球科学》的微信公众号“科普圈”介绍，新实验步
骤有几处改变，其中包括“血清品牌由Hyclone 变更为Gibco”，“溶解和稀释质粒及
gDNA 的缓冲液变更为水（pH 8.0）”，“建议在质粒/gDNA共转染的8小时、12小时或
24小时后，补转一次gDNA（旧版方法中只提及了‘24小时’）”等内容。
此外，韩春雨还在新版实验方法中列出了4项注意事项，其中包括“NgAgo/gDNA 系
统对细胞中胞内菌和支原体感染敏感，在实验前要仔细确认所使用的细胞株未被污染或
污染已被彻底清... 阅读全帖 |
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H********g
发帖数: 43926 | 8 【 以下文字转载自 Military 讨论区 】
发信人: CatchGodLine (捆仙绳), 信区: Military
标 题: 韩国丹麦摘桃 韩春雨终于被海外千老逼得交待技术秘密
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Jan 23 13:57:51 2017, 美东)
韩春雨终于被海外千老逼得交待了技术秘密
韩国丹麦摘桃
由此可见华人本性的丑陋
华人想保留一些技术秘密有多末难
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在韩春雨的舆论风波逐渐发酵之时，8月8日，韩春雨向非盈利性质粒共享信息库
Addgene提交新版的详细实验方法，并补充了数项应当注意的问题。
中国青年报·中青在线记者在Addgene网站中看到，新版实验方法分为细胞培养、
质粒/gDNA 共转染、基因组提取三个部分，一些实验细节与其在《自然-生命科学》中
发表的论文有所不同。
据 “科学美国人”中文版《环球科学》的微信公众号“科普圈”介绍，新实验步
骤有几处改变，其中包括“血清品牌由Hyclone 变更为Gibco”，“溶解和稀释质粒及
gDNA 的缓冲液变更为水（pH 8.0）”，“建议在质粒/gDN... 阅读全帖 |
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z********i
发帖数: 610 | 9 之前总是听到华人BT老板，心里也很害怕，尤其我自己也找了一个中国老板。来了之后
才发现人很好，一点都不push，他只是偶尔来实验室找人talk一下，实验室人不多，两
个人都有绿卡了。实验条件很好，并且告诉我不要省钱。
想想我在国内转HEK293T 用磷酸钙，这里想用什么转都可以。去别人实验室借了一瓶
FBS，在国内的时候只用国产的血清和Hyclone,我还以为自己借的那一瓶是很好的血清（没办法太土了），回来后被告知，这个是很差的一个牌子，我们实验室从来不买。 |
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h********n
发帖数: 4079 | 10 hyclone是个很差的牌子啊? 不好意思, 我过去做实验太少. 楼主推荐一个好牌子吧. |
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O******e
发帖数: 4845 | 11 以前没注意这个问题，觉得过得去价格低就行了。不知道你们都是用哪家的？
有人告诉我Hyclone的最好。。。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 13 Hyclone 的最好，就是太贵了。我一般都用Sigma 的 |
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n********k
发帖数: 2818 | 15 Yes, 20% FBS (5% FBS+15%BCS or hyclone works well too and much cheaper) will
do better...but it is a bit costly and doesn't really get rid of the
problem though...can play with the co2 level too...
的， |
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o*****d
发帖数: 11 | 16 10L左右的话，GE wave system比较方便，主要是整个cellbag是disposible的
也可以用stirred bioreactor
你可以做10x的scale up。比如 1L 到10L
CHO-S（invitrogen）的话比较皮实，1E5/mL都没太大问题
293F (invitrogen)starting conc. 3-5E5/mL
media的话，如果你不要求高密度，DMEM/F12, rpmi都可以
如果加血清的话更好
很多公司都卖serum free medium
拿CHO-S 做例子，有invitrogen, hyclone, irvineSci等等
wave cellbag不用灭菌，传统的glass flask用蒸汽就可以了
inoculation的话 上youtube看看教程吧
你们表达啥蛋白啊？ outsource是最好的选择了吧
又快又省心 |
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W****7
发帖数: 426 | 17 你用的哪家的培养基，我觉得是培养基出的问题，我也有过几次，我用的Hyclone的。
。。
我现在养了3种细胞最后都出问题，严重怀疑他家的培养基有问题，刚刚order了新的，
试试看。 |
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m***T
发帖数: 11058 | 18 http://www.genomeweb.com//node/1217241?hq_e=el&hq_m=1567445&hq_
NEW YORK (GenomeWeb News) – Thermo Fisher Scientific is acquiring Life
Technologies in a $13.6 billion deal, the firms jointly announced today.
Thermo Fisher was rumored over the past couple of weeks to be in advanced
talks to acquire Life Tech, while private equity firms also had been
reported as working on bids to get a deal done. The transaction signing
comes three months after Life Tech confirmed it had hired Deutsche Bank and
M... 阅读全帖 |
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j*****y
发帖数: 121 | 19 你用的哪个培养基？
SAFC，hyclone或者Gibco的？ |
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发帖数: 1 | 20 新的实验步骤有几处更改，其中包括“血清品牌由 Hyclone 变更
为 Gibco”，“293T细胞贴壁不牢，换液时要小心操作”，“溶解和稀释质粒及
gDNA 的缓冲液变更为水（pH 8.0）
实在忍不住爆下粗口，我操，耍人也要有点诚意行吗？joshhaha，替我问候下你老婆，
等你身败名裂了，也许出于人道主义我可以出钱让你家隔壁老王照顾她一下。 |
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c********n
发帖数: 225 | 21 实验流程第二步：
2. Transfection
更新前
2-1 NLS-NgAgo expressing plasmid is extracted with Wizard® Plus SV
Minipreps DNA Purification System (Promega), and is adjusted to 100 ng/μl
in 0.5x TE buffer (5 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA，pH 8.0).
2-2 5’-phosphorylated ssDNA guides are dissolved to 100 ng/μl in 0.5x TE
buffer (PH 8.0). For each well of a 24-well plate, 200-250 ng NLS-NgAgo
plasmid and 100-300 ng guidesare diluted in 50 μl Opti-MEM (Gibco); 1.25 μ
l lipofectamine 2000 is diluted in 50 μl Opti-MEM.... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 22 更新后的Note部分：
（NBT 原文里没有）
Note:
1.NgAgo/gDNA system is extremely sensitive to contamination of intracellular
bacteria (including mycoplasma) which are widespread and leave no visible
signs of presence. Carefully excluding the presence of intracellular
bacteria before performing experiments.
编者注：不能有细菌污染
2.Because Agos need magnesium, avoid EDTA when detaching and seeding cells
into the plates for transfection. Alternatively, supplementing Mg2+ to 5 mM
(may need optimization to your cell type).
编者注... 阅读全帖 |
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