p****p
发帖数: 3360 | 1 误会了。
我是针对OP把那段序列当作一个ORF而提的问题。如果中间有intron，那么能够被3整除
一点意义都没有。 |
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w*******g
发帖数: 16 | 2 谢谢各位的回复。probe是在exon和intron之间，不会是genomic contamination |
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K****a
发帖数: 161 | 3 我在目的基因CDS 3'端加了一个Flag-tag，然后转化Arabidopsis野生型，用的是35S
promoter。转化植株的第一代RNA水平高的株系挑选出来传代，第二代出现表型分离，
而且符合3：1的比率。用Northern检测第二代植株的RNA水平，发现出现特殊表型的植
株中RNA水平很高，但是用western检测不到蛋白表达。所以我设计了三段探针，分别用
目的基因CDS的前，中，后三部分，Northern结果发现前段和中段探针能检测到高表达
，但是最后一段却没有信号。
现在我想的是高表达的RNA不是全长，所以用Anti-Flag抗体检测不到蛋白表达。但是我
不知道为什么会出现这种情况。构建的用的是CDS，不含任何intron，按理说不会出现
alternative splicing。我现在想的是在5'端再加上一个HA-tag，转化得到过表达植株
，看看会不会出现相同表型，如果有的话，RNA是不是truncated，如果是的话，用Anti
-HA抗体检测看看有没有truncated protein存在。
遇到过这种现象的同学能不能指导一下，我想破脑袋也没想通。多谢！ |
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h****g
发帖数: 439 | 4 不知道，帮顶。PS，你真够Lucky的
a
g.[exon A]--intron--[CT exon]). Does the point mutation likely affect RNA |
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J********3
发帖数: 3151 | 5 T变D或E啥的不行吗？实验证明非得T变A？
a
g.[exon A]--intron--[CT exon]). Does the point mutation likely affect RNA |
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i*********0
发帖数: 915 | 6 Normally I just leave the AG GT in the introns unchanged. I do not care
about the end and beginning of the exon.
whatever, when you have the targeted ES cells, you can detect it with RT-PCR.
G |
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L******e
发帖数: 679 | 7 最近PCR碰到一个奇怪问题。需要从人的genomic DNA 里PCR一个100到150bp左右的片段
（EGFR）。在第一个exon之前的intron里，设计了好几次引物，还是用PCR-BLAST设计
的。结果每次都出来一个1000bp左右的片段，测序后根本不是我要的那个基因来的（
EGFR）。最离谱的是在这里面（新基因全部的基因序列）尽然找不到我的PCR引物序列
。所用工具为BLAST。用BLAST检查引物又都对。
大家碰到过这种问题吗？劳驾给点建议。谢了。 |
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c*********t
发帖数: 340 | 8 ffff6699 is right
I just had an exam on this question:)
siRNA is exogeneous,about 21nt, usually completely complementary
miRNA is endogeneous, about 70nt, processed to give smaller, mature miRNA of
approximately the same size of that of siRNA; usually not 100%
complementary. Could result in mRNA degradation, inhibition of translation,
etc.. For translation inhibition it binds to 3'UTR most of the times but
some miRNA binds to 5'UTR or intronic regions too
This was what i wrote down and got full |
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z****g
发帖数: 972 | 9 看附图。
有没有什么软件能够输入Genomic Sequence，自己可以标记哪里是intron，exon和
insertions？就像画质粒图谱的那种软件一样？ |
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h****g
发帖数: 439 | 10 因为用Trizol或者说任何方法提RNA，都不能保证没有genomic DNA的contamination。所以要在RT前做一下 DNase I treatment
另外一个方法是，设计的引物要跨Intron，这样也可以避免genomic DNA 的contamination 的干扰.
PCR
DNA |
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S*****s
发帖数: 287 | 11 谢谢楼上各位。我正在看这方面的文章，特别是七楼 jcb 老兄列出来的那篇，越看越
觉得不错。我做的蛋白目前没有 endogenous cell line，而我研究的方向也包括 mRNA
intron splicing。现在我都是用引入了 CMV promoter 的 BAC DNA 做 transfection
。看看这些文章我倒是想买点这个 ZFN 然后把 HEK293T 细胞的基因组改一改，改造出
一个可以 endogenous cell line 来。明天和 sigma 的 rep 继续谈谈。 |
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m*********7
发帖数: 606 | 12 不客气，希望你能顺利克隆。
还有一个办法你可以试一下，如果你这个蛋白序列比较保守的话，你可以将已知的序列
，如sequence1,去和其他物种（如小鼠，大鼠，黑猩猩）的genome sequence及已知的
cDNA序列比较一下。高度保守的蛋白在较近的物种间coding sequence的exon和intron
间splice的方式很接近，有助于你判断start codon和stop codon的位置。反正你只需
要知道coding region和很小一部分的5'-UTR和3'-UTR的序列，方便克隆就行。 |
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a****o
发帖数: 1786 | 13 If your target genes have introns, you can design primers that only pick up
mRNA, but not DNA. Then DNase treatment is not important any more.
better
DNA four times and still have DNA left in RNA samples. |
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p*****c
发帖数: 116 | 15 谢谢回复！是在293 细胞株上找到的，本来是用来做正常对照的。
现在也不知道下一步该怎么做？ |
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x*****e
发帖数: 309 | 18 有意义，和mRNA剪切加工有关？
welcome! |
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s********l
发帖数: 1195 | 19 re, maybe a tagging SNP |
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s******y
发帖数: 28562 | 20 如果没有功能表态上的区别，那就没有往下做的意义了 |
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O******e
发帖数: 4845 | 21 Don't waste your time on this. |
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s*********x
发帖数: 1923 | 23 snp, enhancer, TF binding sites. |
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w***e
发帖数: 269 | 24 Here is the problem. We recently developed a mouse knockout line with a
company. The entire gene is knocked out with all the exons and introns
being replaced with a reporter gene (lacZ) cassette. We got the
heterozygous (+/-) mice and I did the breeding. But now I have trouble
genotyping to find out the knockout mice (-/-). I tried two pairs of
primers in that gene to PCR out ~400 bp fragments in the last exon (the
biggest exon which codes the functional domain of the protein). PCR with
one pai... 阅读全帖 |
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S*********e
发帖数: 127 | 25 for example, from GenBank? |
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s*********s
发帖数: 110 | 27 check ensembl
they have detailed information for each gene |
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c*******s
发帖数: 29 | 28 I think you should use the same proportion of the nuclear RNA and
cytoplasmic RNA for the RT-PCR. What's the purpose of your control? You can
do RT-PCR for an pre-mRNA (containing introns which should be exported) to
show your fractionation is clean. |
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c***y
发帖数: 615 | 29 需要补充的是，在类外的物种中，这个consensus sequence 主要位于5' 位点 (ChiP
数据)；换了我的，都跑到intron 或 3' 端了 （ in vitro genomic selection）.
test这个3'端的,是觉得构建luciferase construct的思路清晰些 |
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c***y
发帖数: 615 | 30 最初设计实验时的确在chip-seq 和 in vitro 之间犹豫过。主要是觉得Chip可能会
fish一些co-factor 的binding 序列。后来选择了 in vitro genomic selection,虽然
是in vitro,不过觉得有genomic background， 目的还是obtain a small but
significant sequence group; 出乎意料的是 location, 没有5'端或first intron 的 |
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M*****n
发帖数: 16729 | 31 very likely to be duplicates.
why don't you use the intron sequences to map it? If it maps to two different loci then must be two duplicate genes.
ｎ的都不一样。ｃ |
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Z******5
发帖数: 435 | 32 我就这么做的
Transition C19MC microRNAs are processed from introns of large Pol-II, non-
protein-coding transcripts
A Double-Negative Feedback Loop between ZEB1-SIP1 and the microRNA-200
Family Regulates Epithelial-Mesenchymal
参考这两篇文章，可以用第一篇文章中提到的GSP做第二篇文章中的Figure1C
至于要做定量，最好还是用random hexamers做反转录吧。 我试过random hexamers和
OligodT，结果都是一致的。 |
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l******n
发帖数: 520 | 33 好像有个online程序可以把你的DNA seq map到amino acid seq上
然后看你的突变点处于intron还是exon，对翻译产物有无影响一目了然
其实也可以写个perl |
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S*****s
发帖数: 287 | 34 我想搞清楚一个在细胞质内的突变蛋白是怎么被降解的。这个蛋白的野生型有两种
alternative intron splicing 的 product，姑且叫 wildtype 和 wildtype2 吧。我
在 293 细胞内表达两个 wildtype 和 mutant 蛋白，然后用 proteosome inhibitor
（Lactacystin) 和 lysosome inhibitor （Chloroquine, Leupeptin) 来处理细胞。
实验结果发现 Lactacystin 处理之后 wildtype 蛋白含量不变，wildtype2 含量升高
，但是 mutant 蛋白含量下降了。Chloroquine 和 Leupeptin 处理之后也不见 mutant
蛋白含量升高。Excel 的分析图也随帖附上。这样我就搞不明白这个蛋白是被什么降
解的了。请问版上的各位大牛能不能指点一下，下一步应该从什么角度去研究蛋白降解
？先谢谢大家了！ |
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l*****g
发帖数: 43 | 35 想用knockin表达一个基因（不同种系），为什么有些人用genomic DNA（intron和exon
），而不是简单的full length cDNA？我不需要高表达，只要right amount， right
place。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 36 他这个貌似是用recombinant DNA 作的，应该不存在这个剪切的问题吧？
就算不小心引入突变后把原来的cDNA 变成了intron出现了剪切，也应该是
被剪的更小.
mRNA |
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m***o
发帖数: 272 | 37 我是不是还没有讲明白，急死了。转录和翻译的起始点我都困惑。
这个5UTR是在原来gene的intron里面。
关于翻译的起始点，是不是原则No1是第一个ATG一般就是起始的，No2 才是考虑Kozak
序列。虽然后面的两个有Kozak序列，但因为第一个ATG挡在那里，所以翻译还是从第一
个开始。
关于转录的起始点，我测了20多个序列了。如果第一个ATG的A为0，那么我只有一个在
大概-70（这是最远的），有2个在-4，其余的大概好几个就在+4+5+6位置，还有好多在
+15to+18之间（这个就是3个ATG的下游了）。（原来说的60个bp的差别该改成88个）。
如果在3个ATG的下游，那岂不就没法翻译了吗。不过PCR倾向于拷短的条带，所以有可
能放大了短的片段。
然后我用RT-PCR把5‘引物放在+24，可以看到很强的条带，放到-20条带就弱了很多，
放到-70位置，就更弱了。但是都能看到条带，而且对照很干净，所以就是说这些不同
长度的RNA都存在。而且还有可能-90的位置可能也转录了，但是我没有得到克隆测序。
所以我现在就很想知道转录到底哪是起始点。
另外做5-RACE，大家可以得到... 阅读全帖 |
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g*********d
发帖数: 233 | 38 目前表观遗传学(Epigenetics)通常被定义为基因表达通过有丝分裂或减数分裂发生了
可遗传的改变, 而DNA 序列不发生改变[1, 2]。表观遗传学的机
制主要包括DNA 甲基化、组蛋白修饰及非编码RNA。DNA 甲基化(DNA methylation)是指
在DNA甲基转移酶(DNA-methyltransferases, DNMTs)的催化下, CpG 二核苷酸中的胞嘧
啶被选择性地添加甲基, 形成5-甲基胞嘧啶[3, 4]。DNA 甲基转移酶有两种, 其中
DNMT1 主要起维持甲基化的作用, 能使半甲基化的DNA 双链分子上与甲基胞嘧啶相对应
的胞嘧啶甲基化, 可参与DNA 复制双链中新合成链的甲基化[5]; 而DNMT3a 和DNMT3b
主要起形成甲基化的作用, 能在未发生甲基化的DNA 双链上进
行甲基化[6]。DNA 甲基化一般与基因的沉默相关,DNA 去甲基化则与基因的活化相关[7
~9]。
组蛋白修饰(Histone modifications) 是指组蛋白的基础氨基末端尾部突出于核小体,
常在转录后发生变化, 包括甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化等翻译后的修饰... 阅读全帖 |
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D*a
发帖数: 6830 | 39 我们也是想targeted，现在有目标基因，不想搞gwas那种。我们打算连intron和promotor都测啊。
我今天下午找了几篇测rna的给老板看，我老板还说，我不想只测rna啊。晕。
关键是我们不是测病人的实验室，所以很多东西都要从头弄。他现在想的是让一个人跟
他弄出project来，该学的东西学了，需要帮忙就看看能不能弄钱来招个tech之类的。
如果要手工测，我肯定是不干，我没有动力去揽这个活呀，呵呵。再说我也没有空。 |
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W*****o
发帖数: 1780 | 40 I found a new family of genes, which are very different from orthologs in
other species. They do not have introns. What is advantage and disadvantage
of intronless genes? Thanks a lot. |
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f*********e
发帖数: 24 | 41 retrotransposons
That's why they do not have introns.
DNA -> mRNA -> cDNA ->new gene
disadvantage |
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n******7
发帖数: 12463 | 42 说来惭愧，还做过两年ncRNA，长的短的都做过，但是一直对intronic ncRNA没什么了
解... |
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i******g
发帖数: 90 | 43 TA0100 kit， 用抗生素筛到了30多个克隆后，用基因特异性引物PCR检测，发现所有的
克隆都有野生型的目的基因条带, 但其中的两三个克隆同时有预测的intron插入的条带
，难道我还得再对这几个克隆划板筛选么？ |
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h***9
发帖数: 662 | 44 发生recombination的时候，除了两个loxp之间的sequence会被recombine掉，loxp外端的序列也可能会受影响么？我在设计一个knock in mouse 的targeting vector,打算把loxp放在intron里面，但不知道loxp两边是否应该加一些random sequence.谢谢。 |
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a********k
发帖数: 2273 | 45 花了一个小时，深深的鄙视一下自己的无聊行径！！
125 蔡亮 男 1980年11月 复旦大学 生命
科学 2007年12月毕业于[美国]北卡大学 [美国]加州大学旧金山分校 博士后
Cai L, Mostov K. Polarity is destiny. Cell. 2009 Nov 13;139(4):660-2. PubMed
PMID: 19914162; PubMed Central PMCID: PMC2900917.
Cai L, Makhov AM, Schafer DA, Bear JE. Coronin 1B antagonizes cortactin and
remodels Arp2/3-containing actin branches in lamellipodia. Cell. 2008 Sep
5;134(5):828-42. PubMed PMID: 18775315; PubMed Central PMCID: PMC2570342.
Cai L, Makhov AM, Bear JE. F-actin... 阅读全帖 |
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a***y
发帖数: 19743 | 46 在英国的Xiangchao Gan牛啊。
Genetic differences between Arabidopsis thaliana accessions underlie the
plant’s extensive phenotypic variation, and until now these have been
interpreted largely in the context of the annotated reference accession Col-
0. Here we report the sequencing, assembly and annotation of the genomes of
18 natural A. thaliana accessions, and their transcriptomes. When assessed
on the basis of the reference annotation, one-third of protein-coding genes
are predicted to be disrupted i... 阅读全帖 |
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n******7
发帖数: 12463 | 47 事情是这样，我们用RT-PCR克隆了一些gene的transcript （CDS only），然后丢给454
测了，然后把其中的一些克隆又拿去做了Y2H。我发现有好几个基因都有个特别的
transcript克隆出来。它们的特点是：
1. 超级短。往往gene有七八个exon，这个transcript就在取了第一个和最后一个exon
的各一部分了事。一共也就200个nt左右
2. READS coverage很低。我们平均的coverage在60X+，这几个小东西也就1-2X，因为
也很短，也就是说，就一两条reads支持。很奇怪，因为我们是用clone测序，所以这个
跟表达量也没关系。后续的Sanger data也确认了这些短序列
3. 不是canonical splicing site。把这些序列align的genome的话，都是覆盖最5'和
最3'端的，之间是一个巨大的gap。如果gap是spliced intron的话，对应的splicing
site不是GU..AG。
4. interaction partner往往很多。比如有个transcript，有15个partner筛出... 阅读全帖 |
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t*d
发帖数: 1290 | 48 来接个龙。这个错误怎么样？一篇今年的 Genome Biology 的文章。
Figure S1: pptimal probe melting temperature is consistent in exons, introns
, and intergenic regions.
这个是正文中，给补充材料的说明。不是在补充材料中。补充材料一般更是错误百出。
我自己文章的补充材料也不怎么认真写。 |
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s********r
发帖数: 312 | 49 I think its two different processes. splicing donor/accepter determines
splicing pattern. Exon/intron junction accounts for nonsense-mediated decay,
to degrade mis-spliced mRNA |
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z***d
发帖数: 131 | 50 1.发现Overexpression of 蛋白A会导致gene B表达增高；
2.文献报道蛋白A是一个Non-histone chromatin remodeling protein，它能displace
HADC，从而增加acetyl-H3K9在另两个target genes(C and D)promoter regions处的结
合。
3.另有报道Gene B的表达受HDAC调控。
因此，我的Hypothesis是蛋白A也是通过相似的方式（displace HADC，增加acetyl-
H3K9在genes B promoter regions处的结合)来引起基因B的高表达。
可是今天的Acetyl-H3K9/K14 ChIP结果正好和假设完全相反：在蛋白A高表达的细胞中
，acetyl-H3K9在genes B promoter region和RPL 30 intron 2 (Positive control）
处的结合率显著降低。
疑问：1. 有acetyl-H3K9在promoter region处的结合率下降，但基因表达却开启的例
子吗？
2. 由于蛋白A本身又可以和Hi... 阅读全帖 |
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