e****s
发帖数: 1125 | 1 Western能测出来那应该就是有表达了，特别如果也是这个HA抗体的话，那就是HA-tag
在正常折叠的蛋白中被覆盖了，或者抗体浓度不是很合适？
如果对WB结果不是很有信心的话，换一个HA抗体看看。
另外IPTG条件优化一下肯定有帮助，你的表达肯定很低。有一个方法也可以帮你确定是
否真是你的目标蛋白，随着IPTG的增加，通常在Total lysis里的蛋白量是增加的(Sup
里当然不一定)。如果你能看到在一定IPTG浓度范围内，该条带增加，就表示是你的目
标蛋白了。
Expression test一般用个5ml就可以了，省事些。
pellet
mask |
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x********u
发帖数: 430 | 2 We use T7 promoter for our vector system. We have been very successful to
produce the recombinant protein for bioconversion. Usually we induce the
cell with IPTG for 3-4 hours before bioconversion. But this time I induce
the cell for about 12 hours and I didn't get any products. The cell grows
well and seems normal. What's the consequence if you induce the cell too
long with IPTG? Does this matter with my expression results? Thank you! |
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l*****n
发帖数: 1648 | 3 普通培养方法OD=1就诱导,现在OD=10诱导,IPTG浓度还保持一样的话会不会IPTG不够用啊 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 4 You can try using different media/temp/IPTG concentration to optimize the
expression. I recently heard about this kit:
http://www.athenaes.com/PERK.php
I haven't tried it myself, though. But for $150, I think it's worth trying. |
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j***y
发帖数: 1640 | 5 Lab 要减少开支，一次养10升细菌要用IPTG 2-3g. sigma 和 Fisher 的有点小贵，哪里有便宜一点的木有啊？ |
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W*******a
发帖数: 1769 | 7 few recombinant proteins can be induced to the level that you can
see a difference between control and IPTG with protein stain |
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h**********r
发帖数: 671 | 8 问个弱智的问题，我想在agar平板上筛选，外源基因受IPTG诱导，请问有没有什么好方
法不用转到液体96孔板上就能诱导基因表达的呢？
多谢！ |
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s*******e
发帖数: 1010 | 9 不能直接加到Agar里面吗？我做蓝白斑就是直接配平板的时候加IPTG的 |
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h**********r
发帖数: 671 | 10 IPTG不能直接加到agar里，如果加的话阳性克隆会不长，这是鉴定阳性克隆（例如T7
promoter）的方法之一。
好像液体生长有一种类似于lactose诱导的混合培养基，等glucose用完之后自动诱导，
不记得了，不知道用到agar里可行不。挺麻烦的吧。
另外考虑用非诱的启动子。
我要做个directed evolution，有了一个比较好的筛选assay。看别人动不动就Liquid
Handling/Robotic Lab Automation，所以心里没底。故此一问，想先平板初筛一下。
没有这方面的经验，心里发毛。
谢谢！ |
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f*********p
发帖数: 13 | 11 IPTG induces the expression of T7 polymerase (T7 pol is under the control of
lac, inducible by IPTG), which in turn translates your gene of interest
because it is under the control of T7 promoter and has to be processed by T7
pol, but not E.coli pol. without IPTG, T7 pol has very low basal expression
level, and your gene of interest will have some low basal expression too.
plysS expresses a low level of lysozyme, which functions as an inhibitor for
T7 pol, and thus, with no IPTG induction, inhib |
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g*****y
发帖数: 6325 | 12 我的蛋白bl21(DE3)的细胞里0.5mM IPTG induction 表达很好。后来转到BL21(DE3
pLysS)里 加IPTG却不表达我试过
0.1-2mM的IPTG. 2hr, 4hr 和 o/n. 2mM IPTG O/N 好像有一点点表达。。 都是同样
的蛋白同样的hosting vector. 现
在怀疑是不是BL21(DE3 pLysS)里表达的lysozyme 把我的蛋白降解了? 不太可能啊！
大家有没有遇到类似的情况呢？ |
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H*g
发帖数: 2333 | 13 Thank you, guys!
I sequenced my expression plasmid and I am sure it is correct, no frame
shift, no mutations. I feel my protein
is not toxic to E.coli. I shaked the E.coli culture at 37C till OD600=0.6,
then add IPTG to 1mM. I also had a
second culture but not add IPTG.
I took 1.5mL every hour for 7 hours from both cultures (with and without IPTG), spin
down, sonicated, and loaded side-
by-side on SDS-PAGE, I couldn't see any band being induced.
I would try lower temperature and lower concentrat... 阅读全帖 |
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e****s
发帖数: 1125 | 14 我一般在提一个新蛋白以前，先把温度和IPTG条件做个Expression test。
蛋白量上去了，后面就好办了。
IPTG条件多变几个，我手头的蛋白有10umol诱导的，有3-5mM诱导的，条件差别很大。
IPTG |
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m**z
发帖数: 787 | 15 run gel on the following samples: -IPTG, +IPTG, lysis supernatant, lysis
pellet.
If you have protein in +IPTG sample, then if it is mostly in pellet, that
tells you the solubility in this buffer is probably not great. |
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T**********t
发帖数: 1604 | 16 I meant the amount of IPTG, not the concentration of IPTG... If you use much
less volume of culture (5ml vs. 1 L), the amount of IPTG needs to be scaled
down accordingly. |
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h**********r
发帖数: 671 | 17 长假刚回来。我承认我逻辑更加混乱了。一直有这么个问题纠结：基因表达成蛋白质时
，需要细胞生长吗？比如说E. coli，细胞生长仅仅是稀释作用吗？最简单的IPTG诱导
时，IPTG加得过晚，整个表达量也不会高。那么这个受IPTG诱导的蛋白质的表达，主要
在新分裂的细胞中吗？E. coli的单个细胞也有从小长到大的过程吧？E. coli是不是也
有个“可遗传的诱导状态”？
也许有很多模型解释了，我也没有查。大家能发表点看法吗？多谢！ |
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b********c
发帖数: 161 | 18 invitrogen pEXP5-NT/TOPO vector 和 BL21(DE3)Star competent cell
细胞长到 OD600=0.6~0.8时加入IPTG (final C=0.5mM)诱导表达, 25C和37C都试过,时
间点为2h, 4h 和6h. 然后提纯蛋白和跑SDS-PAGE：诱导前，诱导后，提纯后.
由于T7的leaky expression,我仍然提纯到了我需要的蛋白,关键问题是蛋白的量在IPTG
诱导前和诱导后没有变化。请问到底是哪个环节出错了呢？ |
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b********c
发帖数: 161 | 19 我按照你的方法做了次SDS-PAGE,但并没有发现任何inclusion body的存在.
我实验室里面也有相同的基因在pGS21a vector里面的细菌,所以我顺便也跑了下这个的
SDS-PAGE,在这个vector 里面 0.5mM IPTG确实提高的蛋白的表达量.
因为TOPOvector出错了，还是由于IPTG的浓度需要做调整？ |
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T**********t
发帖数: 1604 | 20 我就是用的BL21(DE3)pLysS strain，用0.4mM的IPTG诱导，表达4hr，蛋白产量很好。
T7 lysozyme是T7 RNA polymerase的natural inhibitor，它的表达是为了抑制在BL21(
DE3)里比较常见的leaky expression，但是这个表达量不至于抑制被IPTG诱导后的
expression。而且lysozyme不是蛋白酶，不可能降解你的蛋白。
你的蛋白如果用BL21(DE3)表达很好，说明你的蛋白对E.coli没有细胞毒性，你可以不
需要用BL21(DE3)pLysS来表达。
还有就是你看一下你用的是BL21系列还是BL21 Gold系列，这两个系列都有(DE3)和(DE3
)pLysS，但是我用BL21 Gold系列就碰到过表达不出来的问题。我说的BL21和BL21 Gold
都是Stratagene（现在的Agilent Genomics）的产品，不知道别的公司是不是也是这么
标识的。 |
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i***0
发帖数: 160 | 21 For inclusion bodies, you have to reduce temperature and IPTG amount. One of
my proteins has inclusion bodies and very small amount of soluble protein.
But when I tried with 10 uM IPTG induction, the soluble part has about equal
amount of my protein compared to inclusion bodies. But when you have
efficient cell breaking method you will release almost all of the soluble
protein from the cells. So try with more expression conditions before you
enlarge culture size. Personally, I like French Press,... 阅读全帖 |
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w*********e
发帖数: 98 | 22 Try low temperature at 18 C, which should start right after you inoculate
the overnight culture into the final culture. Then wait until OD is 0.6-1.0,
add low concentration of IPTG such as 0.1 mM IPTG for 16-20 hours at 300rpm
. I just tried this protocol, it increased a lot the ratio of GST fused
protein in soluble fraction compared with that at 37 C. |
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n***w
发帖数: 2405 | 23 Thank you guys.
I use PGEX2T vector so GST is on the N-terminus.
I normally do 100ml culture size. Here is how I did this:
1. small culture of the bacteria from glycerol stock O/N, about 6-8ml.
2. transfer the small culture to 100ml 2xYTA medium in the next day morning
, shaking at 300rpm, 37degrees.
3. it ususally takes about 1hr 40min - 2 hrs to have an OD600 around 0.75.
4. add IPTG (stock 100mM) 100ul to get a final concentration of 0.1mM.
5. Lower the temp to 22degrees and shake at 300 rmp... 阅读全帖 |
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s********n
发帖数: 2939 | 24 真正工业化生产不可能用IPTG的，IPTG只是在实验室水平用的。 |
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s********n
发帖数: 2939 | 25 真正工业化生产不可能用IPTG的，IPTG只是在实验室水平用的。 |
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t*******n
发帖数: 446 | 26 我们实验室做表达一般是这样的：头天新鲜转化的平板，第二天早上挖下一堆克隆转到
100-200ml LB的培养基中37度摇到OD1.0，离心后转到新鲜配制过滤的N15标记的1升M9培养基中，37度摇到OD1.0后加IPTG诱导。
一直以来都很顺利，不过这一段时间出了怪事：M9培养基扩增的时候OD值升到0.5-0.6的时候就突然开始猛降，培养基也变得澄清，OD值降到大概0.1。如果接着摇OD值还能再升回来，摇过夜的话还能升到1.5左右。培养基中有很多白色絮状物，闻上去不像大肠杆菌的味。这个时候加IPTG诱导，有时能拿到自己的蛋白，有时候拿不到。
大家帮我看看是什么污染？ |
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p****s
发帖数: 3153 | 27 我猜跟抗生素有关，但具体为什么我不知道
M9培养基中，37度摇到OD1.0
后加IPTG诱导。
6的时候就突然开始猛降，培养基
也变得澄清，OD值降到大概0.1。如果接着摇OD值还能再升回来，摇过夜的话还能升到1
.5左右。培养基中有很多白色絮
状物，闻上去不像大肠杆菌的味。这个时候加IPTG诱导，有时能拿到自己的蛋白，有时
候拿不到。 |
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C*********m
发帖数: 213 | 28 春天来了，虫子多了。你的应该是Phage 污染了。
M9培养基中，37度摇到OD1.0后加IPTG诱导。
6的时候就突然开始猛降，培养基也变得澄清，OD值降到大概0.1。如果接着摇OD值还能
再升回来，摇过夜的话还能升到1.5左右。培养基中有很多白色絮状物，闻上去不像大
肠杆菌的味。这个时候加IPTG诱导，有时能拿到自己的蛋白，有时候拿不到。 |
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N*******k
发帖数: 270 | 29 我曾经表达过两个氨基酸相似率高达92%的细胞因子A和B， A是怎么搞也没有可溶性的
蛋白；而B，可溶性表达是惊人的高， 一升的培养体系，可以搞出4mg.
可悲的是,我是从A开始的,浪费了一年半的时间,尝试了各种条件,温度,IPTG浓度,时间,
改成细菌偏好的密码子等等;而在我之前,一名博后也花费了大量时间在这上面,最后她
是遗憾的走人.
我的体会是,尽量用低温和低的IPTG浓度,减缓包涵体生成的速度. |
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l***y
发帖数: 4671 | 30 哪个公司的好用一些？
在看 Open Biosystems 的 TRIPZ lentiviral shRNAmir，以及 Sigma 的 pLKO-puro-IPTG-1xLacO 和 pLKO-puro-IPTG-3xLacO。看着都不错，就是不知道实际上是不是靠谱。
哪位大牛给推荐一下吧。。。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 31 GST-A.B co-expression pls let IPTG and the cultures were maintained at 4°C
for 48-72 h then do that induction
reference:
PMID 23525091
Production of soluble eukaryotic recombinant proteins in E. coli is favoured
in early log-phase cultures induced at low temperature. (2012).
Springerplus. 2:89.
FINDINGS:
A high yield of active soluble proteins was obtained by combining early-log
phase cultures and low temperatures for protein induction. When IPTG was
added at OD600 = 0.1 and cultures... 阅读全帖 |
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E****y
发帖数: 149 | 32 方舟子微博（2月26日21:59分发）转载了一段韩寒接受媒体采访的视频，中
间韩寒接了一个媒体的电话向他约稿，韩寒说：自己写不出来，不好再找人代笔。
这一点对韩寒事件真相的认识有帮助，但不是关键性的，顶多说明韩寒在成名以
后，逢场作戏太多，写不过来，别人给他代笔写文章发表而已。然而方舟子所做
的则是揭露韩寒神话的建立是靠欺诈手段，换句话说，方舟子揭露的是韩寒的
“大造假”和“大代笔”，而这段视频只能说明韩寒的“小造假”和“小代笔”。
两者不是一回事。
然而，就在这段视频里，韩寒暴露出了他“大造假”和“大代笔”的真相。
方舟子的上述微博发出不久，他的微博又转来一则消息，是一个认真听了这段视
频的网友发现的，内容如下：
2009年韩寒中文网对韩寒的采访，除了自证有代笔的电话（33分28秒），16
分30秒也有意思：女主持人问：“你是打五笔的吗？”韩寒答：“不，我是打拼
音的。”女主持人：“那个《像少年啦飞驰》里面那个人是打五笔的，我还以为
你说的是你。”韩寒笑了一下没有回答。以前韩寒说该书写的是自身的经历。
韩寒会拼音输入法而不会五笔输入法，然而其父韩仁均则是用五笔输入法的。
韩仁均所著《... 阅读全帖 |
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D******K
发帖数: 557 | 33 不要投这个，质量不好。
Nature Methods有希望,记得有个IPTG诱导前cold shock提高E.coli protein
expression的，很简单，也发了。很多实验室，包括我自己都独立观察到过这个现象，
就是没有考虑去发这样的文章。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 34 啊，我们从来都是加IPTG前先把细菌在冰上放一下的，这个是从我以前研究生的时候就
从实验室的师兄那里学来的了。我一直以为这个是标准操作呢。居然也有人发了文章？
而且发的Nature Methods？ |
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w*l
发帖数: 2550 | 35 http://www.xys.org/xys/ebooks/others/science/dajia13/hanhan127.
◇◇新语丝(www.xys.org)(xys6.dxiong.com)(xys.ebookdiy.com)(xys2.dropin.org)
◇◇
韩寒作品为其父韩仁均所写的第一手证据
作者：石毓智
说谎打乱了生活的正常逻辑，所以谎言不在这里暴露，一定会在别的地方露
马脚。而且说谎者一定要有超强的记忆，要清楚以前自己写过什么、说过什么，
否则总会有一天现原形。
方舟子微博（2月26日21:59分发）转载了一段韩寒接受媒体采访的视频，中
间韩寒接了一个媒体的电话向他约稿，韩寒说：自己写不出来，不好再找人代笔。
这一点对韩寒事件真相的认识有帮助，但不是关键性的，顶多说明韩寒在成名以
后，逢场作戏太多，写不过来，别人给他代笔写文章发表而已。然而方舟子所做
的则是揭露韩寒神话的建立是靠欺诈手段，换句话说，方舟子揭露的是韩寒的
“大造假”和“大代笔”，而这段视频只能说明韩寒的“小造假”和“小代笔”。
两者不是一回事。
然而，就在这段视频里，韩寒暴露出了他“大造假”和“大... 阅读全帖 |
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f*********p
发帖数: 13 | 36 I do not think you fully understood my answer to your question yet. let me put
it this way.
what kind of BL21 are you using? BL21 has BL21 (DE3), (DE3) pLysS, ...
different subtypes. I assume that you are using DE3 related strains. DE3
strain has a lambda phage lysogenized in BL21 e.coli, on which there is a T7
polymerase gene under the control of lac promoter. when you grow the cells up,
no or very little T7 pol can be expressed. when you add IPTG, it induces the
expression of T7 pol, which the |
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s******y
发帖数: 28562 | 37 In my own experience, GST is not a good tag because such reason:
1. the GST is on the C term, so , even the protein is not completely
expressed, the GST is still there.
2. GST has a tendency to form dimer (just like what others said)
In your case, it is very likely your protein wasn't expressed correctly.
You can try to induce it by a lower dose of IPTG. In our lab's experience,
sometime it helps to express big proteins. It is also a possibility that you
may introduce a stop codon inside your pr |
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r****o
发帖数: 105 | 38 本文献给YL
（六）兴风作浪的乳糖(lactose)
晚上每天都有人做报告，我觉得让我收获最大的是Bill Studier的报告。本来这个报告是后来才听到的，
但是由于Burgess的模块是唯一的涉及大肠杆菌钟表达蛋白的，我把这一段提前来说说。Studier这老哥是
Brookhaven National Laboratory的，一生研究T7 噬菌体，也是T7 RNA polymerase induction
system(pET 系列质粒)的发明者。
T7 系统在大肠杆菌表达蛋白的应用实在太广泛了，但凡表达蛋白的兄弟姐妹们的不可能不知道这个
系统。长话短说，pET系列的质粒都用T7 promoter来控制基因的表达。T7 promoter只能被T7 RNA
polymerase 识别，而这个咚咚大肠杆菌是没有的。但是有一些溶原菌株,染色体里面已经整合入了由
LacUV promoter和lac operon控制的T7 RNA polymerase 基因片断。如果在细菌培养基里面加入
IPTG, 来诱导T7 RNA polymerase 的表达，就可以启动目的蛋白的表 |
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z****u
发帖数: 2629 | 39 比如IPTG，X gal，DTT等等我们常用的几种，去fisher，sigma大公司一看，价格惊人
。GoldBio的价格只有人家的1/9，人家卖900多，它卖100多。
你们也有在这公司买很多东西么？
他们其他的东西都reliable么？为啥它价格能这么便宜？ |
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m****m
发帖数: 395 | 40 实验室的Amp用完了，Order要好久一段时间，于是就用Carbenicillin代替，加了同样
浓度同样体积的量，结果细菌产量减半，尤其是加 IPTG后的 M9 MEDIA，蛋白产量减半
。查了网上都说Carbenicillin好，就搞不懂了。难道是用量要减半吗？请指教！！ |
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k********u
发帖数: 2209 | 41 看了下，这个蛋白做的挺多的，而且也不是膜蛋白。。。
前面有个人都提到了，我觉得首先你要考虑目标基因的来源，如果和
表达的系统差距比较大的话，先考虑codon variation的可能性。
其次，如果C端有其它tag的话，可以直接破细胞检测下，看是不是表达中止。
如果是降解的问题，试试看蛋白酶抑制剂，对于大肠杆菌，还可以试试看低温
诱导，或者不用IPTG，还有其它诱导方式的。 |
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z****g
发帖数: 972 | 42 要求：
1.来源于Col-0的幼苗
2.经过了nomalization,减少了abundant transcripts,比如actin, tubulin等
3.host为普通E.coli,比如W3110或DH5a
4.所在质粒需为E.coli compatible的质粒，本身带有RBS (ribosome binding site)
5.可以受IPTG诱导直接在E.coli中表达
自己google了一堆，没找到合适的。如果板上哪位知道哪里可以购买，请pm |
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h**********r
发帖数: 671 | 43 以前有些paper做这个的，多个基因的表达，现在我也懒得找了。
另外比较简单的方法，分别把a,b基因克隆在pET21b上，再做一次PCR得到连同启动子，
a基因和terminator，再酶切连接到b基因的表达质粒上。最终a,b都有自己的T7
promoter,都受IPTG诱导。当然诱导程度不一定相同。
这样你就不纠结了。 |
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m****m
发帖数: 395 | 44 膜蛋白难表达是很正常的事。
先把各种可能性一一排除，然后确定原因。各个击破。一次改变一个条件，一次解决一
个疑问。
关于测序的事，如果可以的话，还是想想办法做一下。
先从涂板开始，每个菌落小量摇菌，检测质粒的存在，还有生长活性。标记好有质粒的
菌，挑选最有活力的菌进一步做表达蛋白，有几个问题需要解决：OD生长到多少的时候
开始换培养基最好？（一般是对数生长期吧，不过自己也可以试一下在不同生长期）。
更换培养基后，多久以后开始诱导？（我一般是1个小时以后，不过你可能不同，要试
一下）。分几个不同的温度进行诱导（更换培养基后就用这个温度）、诱导多久后膜蛋
白表达量最高？（这个就要麻烦你要每隔一段时间取点菌去测一下有没有蛋白了）最后
决定最佳诱导温度和时间，还有你说的IPTG量的问题，也可以试一下，抗生素的浓度也
要控制好，太高菌就不长了，太低么要长杂菌。最后裂解细菌，看你用什么方法了，裂
解完离心后膜蛋白有可能在上清液里，也有可能在PELLET里。确定这个以后，就可以开
始纯化了。总之每个步骤都要严格监控，别把蛋白弄丢了。
小小建议呈上，希望对你有所帮助，祝你成功~ 实在不行，最后可以去做 |
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g*****y
发帖数: 6325 | 45 如果IPTG不好用，试一下autoinduction。 还有你追加Amp一点用也没有，media里的酶
很快就全部掉了。你必须
centrifuge down cell, 加入新的medium. |
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s********n
发帖数: 2939 | 47 一般来说加了IPTG对蛋白的表达会有明显影响的，如果可溶部分不变的话，很可能都跑
到inclusion body去了。
不过优化蛋白表达是很费劳力的活，如果你的实验对蛋白量要求不大的话，leaky
expression也能凑活着用。 |
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k*****o
发帖数: 1486 | 48 re确实是的. IPTG浓度条件变化确实很大,另外诱导温度,25度可能还不够低,有的时候
18度也可能产质量更好的蛋白. |
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v**********m
发帖数: 5516 | 49 The GST-tag will artificially increase the solubility of unfolded proteins
fused with a GST-tag, however after the GST-tag is chopped off by a
protease (mostly likely specific ones) the unfolded target proteins will
precipitate out in solution.
GST-tag has nothing to do with the toxicity of a certain protein.
The truth is that most of mammalian proteins or mutant proteins are not 100%
soluble when they are over- expressed in bacteria. What you may do is to
increase the portion of soluble protein... 阅读全帖 |
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n***w
发帖数: 2405 | 50 最近做了几次，然后用Western去检测蛋白表达，目的条带在supernatant，不在pellet
中，尽管除了很浅的目的条带外，还有其他蛋白条带（信号很强）。但是如果用HA－
tag抗体去probe，却detect不出目的条带（有些非特异性的带）。是HA-domain被mask
了？还是说我的蛋白压根就没有表达。。。。
我又回去查了一下序列，没有错。。。。
大家帮我一起troubleshoot说说。。谢谢！ |
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