m******m
发帖数: 535 | 1 刚刚接触细胞生物学，没做过knockdown，这里问两个关于mammalian细胞knockdown的
初级问题，请大家不要笑话。
1） 准备在raw cell line 中 knockdown一个kinase，初步看看对下游cytokine的表达
有没有影响，看文献有人用Dharmacon的siRNA pool转化，有人用lentivirus shRNA，
请问哪种方法更简单？
2） 如果直接转化siRNA，等3－4天以后，细胞都分裂了好几代了，是不是每隔细胞内
的siRNA的量减少很多，这样是不是knockdown的效果就不好了？
3） 为什么siRNA可以直接转化knockdown基因表达，但是好像很少人直接转化shRNA去
knockdown的？为什么shRNA都要科隆在plasmid载体或者virus载体内呢？直接转化难道
不能被dicer酶加工变成siRNA吗？（因为从文献上查到了一个shRNA的序列，如果能直
接合成然后象siRNA那样转化，岂不是能剩了买siRNA的钱，又剩去了科隆shRNA到载体
的时间）。
比较初级的问题，请别笑话！
谢谢！ |
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s*******l
发帖数: 2445 | 2 一个朋友之前做的一个knockdown/knockout gene expression的technique申请了专利,
最近和他聊天谈起把它商业化的前途。
他的技术的背景是：RNAi Knockdown的efficiency有时候很低，他的technique可以和
RNAi一起用来更好的降低endogenous的蛋白表达水平。所以他想考虑做一个service或
者reagent的公司提供一些热门gene的combined knockdown,也可以根据客户要求来做
customized的服务。
现在在做一些初步的市场分析调查，因为自己不是之前不是做这些的，想请教一下有没
有好的关于RNAi Knockdown的efficiency的综述文献，或者目前普遍在用的siRNA的一
般的knockdown效率的数据。非常感谢！ |
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t****g
发帖数: 120 | 3 我最近一直在做一个gene的knockdown cell line。 用的是open biosystems的pLKO.1
system。 try了三个不同的cell lines，发现一个普遍问题： 细胞养了一个月之后我
就不同程度地丢失了最开始的knockdown. 我会详细解释一下我的做法，请大家帮我看
看问题到底在哪儿：
day 1: plate cancer cells for transduction
day 2: add virus/polybrene to cells (half volume of media) in the morning;
6hr later, add the other half volume of media to dilute polybrene
day 4: change to selection medium
day 5: in my case, usually the cells have become confluent before the effect
of antibiotics became obvious. I had t... 阅读全帖 |
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t****g
发帖数: 120 | 4 谢谢回复！
我开始也以为是影响survival，还挺高兴，以为发现了这个gene的一个作用，可在
knockdown的细胞里，也没发现有increased apoptosis。
原来这是个common issue吗？ 我做knockdown的细胞的一个主要目的是收RNA做
microarray，好看看这个gene影响到哪些genes/pathway。 为严谨起见，我从不同的
passage收RNA，而不是一个passage好几个盘子。 可因为这种loss of knockdown最后
我都收的RNA都不能用了。
如果用inducible knockdown的话，用多长的time window为好呢？ 3天？ 一个星期？
还是各有利弊只能做做看？ |
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H*****e
发帖数: 120 | 5 Whenever I review manuscript with knockdown. I have two requirements:
1. By multiple sequences.
2. By western-blot. Even you can detect it by array or PCR, I still ask you
to do it because I feel I am being fooled. Many knockdown in my hand is
partial blocking translation + partial inducing degradation.
For certain cases, I ask for stable lines not oligos. For these reasons, I
had rejected quite few manuscripts from China. They like to show knockdown
using oligos and like to show knockdown ef... 阅读全帖 |
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w********u
发帖数: 5457 | 6 最近头都大了，要在老鼠的cell line里面过表达和knockdown一个gene，选了L929细胞
，觉得挺简单的试验，结果两个礼拜下来，杯具了。
先是knockdown，试了siRNA pool和shRNA plasmid （4 clones），均没有knockdown效
果。重新design了shRNA，准备再试。
又做了overexpression，openbiosystem买的construct，CMV promoter （pCMV－
SPORT6 plasmid），CDS测过序列，完全正确。转染了，western blot，又啥也没有高
表达。转染效率40％－50％。
目标基因是个胞质胞核穿梭蛋白，结合RNA，功能重要但研究文献不多，表达量各个细
胞不均一，但是knockout老鼠胚胎很早死亡，无KO老鼠。
请教有经验人士，可能是啥原因？是不是L929这个细胞朱就是不容易搞啊？如果是，有
啥别的老鼠细胞容易搞的？或者还是有别的可能？
谢谢拉！ |
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c*******7
发帖数: 314 | 7 ft，为啥要puro select两到三周阿？太长了，2天就可以。2-3周我整个试验都做完了
。建议重新做一次，用早期的细胞看knockdown，我一般select完了立刻做wb。我的细
胞一直keep在半量的puro里面，3个礼拜之后好几个shRNA的knockdown明显就减弱了，
从90%降到50%knockdown |
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z********o
发帖数: 137 | 8 大家遇到这样的情况吗？在送totalRNA去做microarray之前做qPCR确定了
knockdown的效率有73%， 但是micoarray做出来只有～50%。后来又去做了RNAseq，结
果也差不多。microarray和RNAseq的结果看，这个被knockdown的factor几乎没引起什
么基因表达的变化。但是在蛋白水平上，这个factor几乎被knockdown清除了。不知道
是怎么回事？是不是这个factor根本不值得做，还是在我这类细胞里不是作为转录因子
起作用的？
还有，我的RNAseq的library是让学校的测序部门做的，然后他们再测序。测
100mer/reads，一共测了30 million。但是得降到70mer时mapping efficiency才只有
～50%左右。那这个测序结果好吗？可信吗？我刚接触这些东西，分析也是一个专门做
bioinformatics的韩国学生帮我分析的。
希望各位能人帮我分析下这些问题。谢谢呀！ |
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C***Y
发帖数: 61 | 9
1
effect
the
It is common issue with shRNA knockdown, so do not get frustrated. If you
can get enough cells for downstream experiments at day 5 or 6, just harvest
cells at that time point, otherwise, I suggest you use inducible knockdown. |
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z********o
发帖数: 137 | 11
knockdown的效率是从qPCR看mRNA的表达量。
我这个gene研究的不多，在我这类细胞里面也不晓得有什么具体功能，所以假设是
marker gene。knockdown后做microarray和RNAseq确实没什么结果。 |
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c*****u
发帖数: 357 | 12 引物能p出东西就行，验证的时候尽量加positive和negative control
关于knockdown， 你有没有比较forward 和reverse 两种方法，有的时候在效率上会差
很多（如果你用的脂质体的话），GFP那个其实也不能很好的决定你target gene的
knockdown效率，还是在oligo的选择和oligo和转染试剂比例上找条件，可以买
validated siRNA，成功率更高些 |
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h***a
发帖数: 145 | 13 想问下一般knockdown 的效率怎么样？跟in vitro 比起来如何？ |
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a******n
发帖数: 392 | 14 如果要在细胞系里同时knockdown两个基因，怎么选择RNAi的方法阿？siRNA,
lentiviral shRNA? 效率哪种高？ |
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a***e
发帖数: 1010 | 15 Both siRNA and lentiviral shRNA methods are good enough to reach your
goal.
However, lentivirus usually has a higher infection efficacy than
transfection method. Therefore, using lentiviral shRNA may be a more
efficient
way to knockdown gene expression. |
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o**4
发帖数: 35028 | 16 我用了3个不同位点的shRNA，去做knockdown，
然后用2对不同的引物去检测靶向表达，
得到的结果都是剧烈上调。
怎么解释啊？
O(∩_∩)O谢谢 |
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o**4
发帖数: 35028 | 17 我同时做了很多个knockdown，同时用realtime检测，
只有这个有问题， 技术上应该没有问题 |
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o**4
发帖数: 35028 | 18 siRNA是瞬时转染，只能维持几天，对于一般细胞来说，比shRNA lentivirus简单好用。
shRNA lentivirus主要是为了稳定转染，建立knockdown的细胞系，需要构建质粒、做
病毒，然后infection，麻烦些。 |
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s******a
发帖数: 472 | 19 Knockdown of the gene confers survival disadvantage? |
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q******g
发帖数: 3858 | 20 我们用pLKO.1也有同样的问题。一般都是在split cell后一天，才加入puromycin. 一
般经过3-4天，没有感染的细胞（negative control）会全部死去。这个时候，你可以
冷冻一些细胞，用于以后的实验。而经过删选的细胞用过2-3周，就不用了。使用冷冻
的。
knockdown efficiency我的基因也只有60%左右。我觉得这个和shRNA的设计有关。当然
，很多公司会重新给你设计或者退款，如果达不到80%。 |
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B******o
发帖数: 496 | 21 pLKO.1本身就是lentiviral vector. 你用它在293细胞内生产lentivirus。然后用
virus直接infect你的目标细胞。感染后，vector大概需要2-3天开始表达你的shRNA，
你再等个2-3天就可以看knockdown的效率了。生产virus的时候你需要co-transfect
virus packaging vector。 SBI的那套效率不错。Addgene上也有类似的，具体的条件
得自己摸一下。
pLKO如果只是做transfection的时候KD效率不咋的。但用virus去KD基因的话，5个
shRNA至少有2个都能超过70%。
infect过的细胞因为virus是整合在基因组上的，可以养很长时间，即使不加药筛
选。 |
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h*******u
发帖数: 126 | 22 我做miRNA 用overexpression 效果不错,已投稿.
但是,审稿人要让ＬＮＡ 去knockdown 看效果， 我做了，没有得到预想的结果,怎么
回答审稿人呢？
万分感谢！ |
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h*******u
发帖数: 126 | 23 shakuras, 您好！
具体到给reviewer应该怎样写呢？我用的是invitrogen的miRNA inhibitor to
Knockdown
谢谢！ |
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g****0
发帖数: 425 | 24 想要在老鼠肌肉内knockdown和overexpress一个基因，用什么virus最好呢？有经验的
请介绍一下，或者知道谁做的好吗？ 谢谢。
btw，来不及等TG和KO的data（还没开始呢），但是文章要in vivo data，所以才想用
viurs的。 |
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t**********a
发帖数: 14 | 25 knockdown某基因后3天细胞开始死亡，最后基本死光，剩下很少部分。
大家遇到过这个情况吗？求解？
这个基因研究较少，不知道该从哪些方面去考虑。 |
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A******y
发帖数: 2041 | 26 That's pretty good. Not so many siRNA (I assume) knockdown actually kill
cells. Most of them just anti-preoperative. |
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S*********s
发帖数: 304 | 27 There are lots of genes which are essential to cell survival.
I do not think you should go for it just because of cell death unless you
have other data.
According to genome-wide screen data I got, there are 100-300 genes are
required for cell survival(knockdown cause 70% death).
你要问自己一个问题，做这个课题的目的是什么。不然做着做着就lost了。 |
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d*****i
发帖数: 3905 | 28 用lentivirus deliver shRNA， infect后puromycin select 2到3周，先做RT-PCR，显
示最高knockdown efficiency有70%，细胞冻了后解冻做WB，显示protein几乎没啥变化
。Antibody可以detect FLAG-tagged的protein，所以觉得antibody似乎问题不大。
大家都啥建议？？Thx |
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i*****g
发帖数: 11893 | 29 puro selection no guarantee stable knockdown
puro只要一点点 就可以保证细胞活下来
但是，表达一点点，未必能有足够量 miRNA shRNA production |
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m****M
发帖数: 360 | 30 最近在筛选那个片段的knockdown效率最高。现在有将近上百个
片段（质粒）要筛选。原来少的时候都是用MIDI提取后，做细胞转化，再做QPCR来筛选
。现在上百个样品，都这样工作量大不说，还特别浪费。大家给推荐个小提质粒可以用
来转化细胞的KIT。谢谢 |
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K**4
发帖数: 1015 | 31 你的knockdown的效率指的是什么
一个特定的marker gene 的表达？
感觉如果敲掉个基因，芯片和RNAseq总会出来结果的吧 |
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i***l
发帖数: 1656 | 32 firstly,
time point of your mRNA knockdown
=/=
time point of your protein clearance
1.5,
i saw good KD on WB with ~70% on qPCR before, probably due to different
sensitivity of WB and QPCR
2.
is normalizing control gene the same in different methods? |
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z********o
发帖数: 137 | 33 time point很重要。我最开始做microarray是用的诱导shRNA表达knockdown后48h的细
胞做的。只找出了10个左右的gene有2-fold change，都是零散的，这样的结果是没法
做GO term的。后来看了下protein的变化，在诱导shRNA表达后第四天，蛋白几乎被
clear了。所以有拿这个时间点的样品去做RNAseq，结果还是不行。 |
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z********o
发帖数: 137 | 34 我的细胞是stable cell lines。先用WT确定了KD后，才决定去测microarray和RNAseq
的。
you
I
knockdown
an |
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v***a
发帖数: 1242 | 35 的确如此
you
I
knockdown
an |
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z********o
发帖数: 137 | 36 苦命人，严重怀疑课题方向存在问题，但是还是不得不做呀！knockdown之后RNAseq
，microarray结果都非常flat。后来老板非要上了ChIPseq，结果也是不太理想。自己
不会分析，分析的人就说有几个peaks很强，挑出来了，但是这几个target在RNAseq和
microarray里根本就没变化或者没被测到。懂的朋友能解释一下吗？
我老板从来不来实验室，跟别说做实验。估计文献都只看个标题，最多摘要。而且
还是那种给他一颗沙，他能意淫出一座金矿的人。我这个课题根据就是，人家两百多页
的专利上一堆microarray结果，列了个表说我现在做的这个东西跟一种cancer的预后不
良有关。实际上写这个专利的大牛实验室发了无数文章中从来没有提及这个蛋白。我老
板就东扯西拉，找了个人帮他做了些初始数据申请了一个州内的grant。那些初始数据
很不严谨的，其中一张WT图怎么看怎么像造假，没有内参，我做出来的跟此有很大出入
。感觉就是故意把想要的结果调强，不想要的调弱。我进了实验室后，就没听说我老板
还能跟他这位“朋友”取得联系，email人家根本就不理，打电话也不接。... 阅读全帖 |
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h*****5
发帖数: 9 | 37 What is the knockdown efficiency in RNA and protein level? |
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j**W
发帖数: 89 | 38 请教一下,想做inducible shRNA knockdown in mammalian cells,大家有什么好的
vector/system推荐吗? Thx! |
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s*********m
发帖数: 16 | 39 Patient-Derived Xenograft是做药理实验很好的模型。想请教一下各位大牛，Patient
-Derived Xenograft可以做基因功能研究吗？比如knockdown或者overexpress一个基因
，看看对肿瘤生长的影响。 |
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d*p
发帖数: 534 | 41 这几年一直在做高通量的shRNA筛选，感觉现有的产品有很大缺陷，想开发以下产品：
现在做功能研究比较快,能够进行高通量的就是knockdown and over-expression 这两
种方法。因此想做下面两类产品：
1， 覆盖全基因组的shRNA和siRNA， 每个基因两条， 每条的knockdown效率经过验证
，保证大于80%，提供蛋白水平的knockdown结果。
2， 覆盖全基因组的cDNA表达库，克隆每个基因的cDNA到Lenti-vector, 带上Barcode。
算了一下成本，用我的方法，大概5m 美元能够做完人和小鼠的这两个库，Broad现在也
在做，但是他们的方法效率太低，结果还非常不可靠，按他们的方法，50m都不够。
完成以后,
1. 可卖单个基因的产品，和市场上的公司竞争，全球市场大概有5亿美元左右的市场。
目前市场上的shRNA基本都是卖几个给你，不知道那个有用，有时候一个有用的都没有
，或者knockdown太低，看不到表型，需要自己花时间去验证。
2. 全基因组的knockdown 和over-expression library完成后，每个基因有两... 阅读全帖 |
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y******u
发帖数: 246 | 42 我是学工程+bioengineering，只是随便分析分析：
现在知道的是：
shRNA A knockdown = B 表达水平下降
siRNA A knockdown 100% = B 没影响
siRNA A knockdown 80% = B 没影响
siRNA A knockdown 50% = B 降解加速
如果rescue无法排除脱靶的话，
你试一试siRNA A knockdown 30%和10%，看看吧。。。 |
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d*p
发帖数: 534 | 43 这几年一直在做高通量的shRNA筛选，感觉现有的产品有很大缺陷，想开发以下产品：
现在做功能研究比较快,能够进行高通量的就是knockdown and over-expression 这两
种方法。因此想做下面两类产品：
1， 覆盖全基因组的shRNA和siRNA， 每个基因两条， 每条的knockdown效率经过验证
，保证大于80%，提供蛋白水平的knockdown结果。
2， 覆盖全基因组的cDNA表达库，克隆每个基因的cDNA到Lenti-vector, 带上Barcode。
算了一下成本，用我的方法，大概5m 美元能够做完人和小鼠的这两个库，Broad现在也
在做，但是他们的方法效率太低，结果还非常不可靠，按他们的方法，50m都不够。
完成以后,
1. 可卖单个基因的产品，和市场上的公司竞争，全球市场大概有5亿美元左右的市场。
目前市场上的shRNA基本都是卖几个给你，不知道那个有用，有时候一个有用的都没有
，或者knockdown太低，看不到表型，需要自己花时间去验证。
2. 全基因组的knockdown 和over-expression library完成后，每个基因有两... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 44 首先，韩春雨目前暂时还没有拿CR的那篇文章为自己作证，贴吧里的内容很难证实。
不过确实有一些人拿这篇文章为韩春雨洗地，比如科学网里那几位高呼韩“春雨亮剑了
！”“NgAgo确实能识别和结合特异DNA序列，下一步就是编辑了！”
老实说，我对这篇文章非常不满，它最后的结论居然是NgAgo提供了另一种在斑马鱼体
内进行knockdown的策略！作者还跑出来说他们的研究既不支持也不反驳韩春雨的结论。
荒谬！！！
这篇文章如果是质疑韩春雨的NgAgo，那么它的聚焦点应该是NgAgo的基因编辑功能，而
不是knockdown，NgAgo的knockdown只是附属结果，而且是一个没啥大的科学意义的结
果。最后的结论应该是，NgAgo不具备基因编辑的能力。只有这样，在当下，它才有发
表的价值
如果这篇文章是为了找到一种knockdown的蛋白，那有个屁的意义，基因沉默的手段多
了去了，这文章最多发个省级期刊，知网收录的那种。
总而言之，一篇既不支持也不反驳NgAgo基因编辑的研究，发了有个毛的意义？反而搅
混水，误导大众！
此外：
13太保里面早就有人说了！他们通过荧光标记发现NgAgo根本就没有在... 阅读全帖 |
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D****g
发帖数: 275 | 45 谢谢回复。
1. 可能knockdown的效率是太低了。我做的细胞是一种增殖很快的细胞，如果每两天传
代一次，需要稀释20倍才行 （0.5ml/10ml）。在不同的时间检测siRNA knockdown的效
果，发现在24小时是最好的；48小时后 mRNA 差异已经变小；72小时后已经几乎没有区
别。所以说，连着几次转染由于转染试剂毒性的问题也不太可能。可能需要试一试
shRNA，看效果是不是会好些。
2. 我也担心20%的差异可能太小了；但是唯一值得安慰的是，重复了4－5次，每次都是
降低20％以上，即使直接knockdown基因F自己，也只是比knockdown transcription
factor G略低而已。
3. Gene G has six homologies in mammalian cells, with two of them
specifically expressed in this cell lineage, expression of the other one is
very low (below the detection threshold of ... 阅读全帖 |
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e****p
发帖数: 354 | 46 在HELA 分别和一起中KNOCKDOWN 2 基因A和B，先前已证明两者coIP.
用WESTERN测P21, KNOCKDOWN A P21上调2倍，KNOCKDOWN B P21也上调4倍，但同时
KNOCKDOWN A和B，P21反而不变了，没有协同效应？ 百思不得其解。
请教各位大侠！是否有这样的例子，如何解释啊。 |
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S**r
发帖数: 2478 | 47 作knockdown比orange peel要贵，因为orange peel就是用很少的材料喷一下就行，
knockdown用的材料要多很多，还多出压平这一费功夫的步骤。
另外knockdown，orange peel效果跟年代没有关系。但也可能是现在的开发商为了节省
人工，倾向于作orange peel。 |
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m****M
发帖数: 360 | 48 谁有shRNA Screening的经验，给参谋一下。
涉及到的问题
１。同一个老鼠基因的SHRNA是否在所有组织的细胞中KNOCKDOWN效率都是一样的？
２。什么病毒的侵染效率最高？Lentivirus还是Adenovirus?
本人想screen一个老鼠基因的shRNA，从５个shRNA中找到knockdown效率最高的一个shRNA （针对同一个基因）。由于要转化的细胞系比较难转化，准备在一个比较容易转化的细胞系里screen，比如3T3L1等。等筛选到knockdown效率最高的shRNA后，做成病毒去侵染我最后的细胞系。为了偷懒，不想把５个shRNA都做成病毒，请问此方法是否可行？有没有这样做的大狭？
谢谢。 |
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m****M
发帖数: 360 | 49 谁有shRNA Screening的经验，给参谋一下。
涉及到的问题
１。同一个老鼠基因的SHRNA是否在所有组织的细胞中KNOCKDOWN效率都是一样的？
２。什么病毒的侵染效率最高？Lentivirus还是Adenovirus?
本人想screen一个老鼠基因的shRNA，从５个shRNA中找到knockdown效率最高的一个shRNA （针对同一个基因）。由于要转化的细胞系比较难转化，准备在一个比较容易转化的细胞系里screen，比如3T3L1等。等筛选到knockdown效率最高的shRNA后，做成病毒去侵染我最后的细胞系。为了偷懒，不想把５个shRNA都做成病毒，请问此方法是否可行？有没有这样做的大狭？
谢谢。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 50 首先，把大牛这个词眼删了吧。我看了标题后半天不知道我该不该回帖。
然后，你这个问题，得通过各种手段一一排除。
１。先用RNAi control knockdown, 来证实不是knockdown 的副作用。
２。用其他方法来抑制myosin, 看看是否有类似效果。
上面两者都证实之后，再用比较简单的方法一一来检查你说的那几种可能性。
１。用其他蛋白来影响golgi stack
２。knockdown ZBP
3. slightly disturb actin by over-expressing capping proteins. |
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