m******5
发帖数: 1383 | 1 even in my case ? it
is in between of my last exon and 3,utr |
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m******5
发帖数: 1383 | 2 I actually want to take advantage of the polya downstream of neo in case I
don't want to pursue 3,utr function |
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m******5
发帖数: 1383 | 3 而且我手头没有选择标签for co transfection... |
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g***y
发帖数: 201 | 4 不是很明白为什么要在bacteria里面删除neo, 难道不用在ES cell里做selection么？
SW105 has an arabinose-inducible flpe gene ,做bac recombineering 的 lab不是
通常都有sw102,105,106系列菌株么？
位置 |
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s******r
发帖数: 2876 | 6 找找周围的实验室，要个vector。
而且我手头没有选择标签for co transfection... |
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m******5
发帖数: 1383 | 7 though it is not directly relevant to my post, I still apreciate that!!thank
you! |
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O******e
发帖数: 4845 | 8 其实还有一个很重要的原因，就是以前很多实验室一个老鼠就可以维持好多人好多年
的科研，所以别人来要，总是要担心自己的生计。很正常。
现在做knockout transgenic knockin啥的越来越容易，而且JAX也在努力收集散养在
各个实验室的老鼠系，IKMC正在试图做遍所有基因的KO，所以这个问题会慢慢得到解决。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 9 恩 最佳是捞现成的flox的老鼠跟不同的cre和疾病gene交 省了十年工夫 哈
LZ
if you want to know more about this topic,
pls refer one old post:
同主题阅读：Re: 据说做果蝇和线虫的都是相亲相爱大家庭，有人现身说法一下
[版面:生物学][首篇作者：Dua] , 2012年08月23日
that post reply:
发信人: Oncogene (何时问天), 信区: Biology
标 题: Re: 据说做果蝇和线虫的都是相亲相爱大家庭，有人现身说法一下
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Aug 24 11:37:30 2012, 美东)
其实还有一个很重要的原因，就是以前很多实验室一个老鼠就可以维持好多人好多年
的科研，所以别人来要，总是要担心自己的生计。很正常。
现在做knockout transgenic knockin啥的越来越容易，而且JAX也在努力收集散养在
各个实验室的老鼠系，IKMC正在试图做遍所有基因的KO，所以这个问题会慢慢得到解决。
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发信人: Dua... 阅读全帖 |
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C***2
发帖数: 62 | 10 Hey, i have aseveral questions to ask for help.
I want to knockin CreERT2 to specific locus, southern blotting suggested
that the ES clones are targeted correctly. But i am not sure if the CreERT2
is functional or not, therefore, i want to detect the function in vitro ES
based assay. My designed experiments is:
1) Electro-transfection of loxp-CMV Driven GFP-loxp plasmid to ES, the
transfected ES cells are split to 2 dish, one dish is treated with 4-OH,
another dish is conrol.
2) Prepare lentivir... 阅读全帖 |
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C***2
发帖数: 62 | 11 Thank you for your reply.
The locus i knockin Cre is expressed in ES with low level. PI want to make
sure whether the inserted Cre work functionally or not before blastocyst
injection.
I recalled that i ever electrotransfer pEGFPN3 to ES, indeed i observed
sporadic GFP. So, i decide to use CMV-Loxp-gfp-Loxp to confirm the
construction.
I feel shame on the third point, how can i make this type of mistakes.
body
Addgene
have
within
in |
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d****d
发帖数: 214 | 12 我上一次knockin 做PCR筛选，居然用错了引物（本来应该用external pair的，实际用
了internal pair),到第二轮筛选的时候才意识到第一轮筛选的错误。当时以为这下完
了，要被老板骂死了。幸运的是就这样筛选出来的“假阳性”居然到后来发现都是“真
阳性”，可见这次targeting的整合率要接近100%。我想整合率高低很大程度上取决于
targeting construct的好坏吧。 |
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l******n
发帖数: 298 | 13 高手，谢谢哦。你说对了，我这个ER表达很低。不过我这个不是cre-ER system的KO.我
这个是knockin一个human transgene on top of endogenous gene, to check the
ectopic overexpress of the protein.我老板说ER正常情况下抑制这个蛋白，一旦加
了OHT,蛋白就活了，我不太懂原理，就是跟着做了。
这种情况tam or OHT有区别吗？
blame |
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t******n
发帖数: 354 | 14 没有这么笨的PI把，发贴的质量太差
一个construct都要２０００-３０００把，做个knockout，knockin的
有3 |
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m*******n
发帖数: 387 | 15 这个是不是太乐观了啊
比如linkage analysis，我看到一个实验室对一个疾病进行家谱deep-seq
搞了好多的family
前面讲的很fancy，感觉跟你的乐观程度一样
linkage analysis，非常sharp的一个峰
几个找到的SNP或者说是mutation，是个很奇怪的点
跟基因和ncRNA多搭不上
一个大牛就问了，你愿不愿做knockin mouse看看有没有表型。。。
问题是下游根本没法做功能性实验，先验证多没法子
请教这个问题在哪里呢？
epigenetics
conclusive |
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d****d
发帖数: 214 | 16 Why do you want to use P2A? I suggest you use T2A. Before I use 2A strategy
to make a knockin mouse, I tested all four 2A and found that T2A is the best
(and the shortest too). |
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m**e
发帖数: 857 | 17 三万年前中国汉族人的进化
http://www.cell.com/abstract/S0092-8674%2813%2900067-6?utm_sour
Modeling Recent Human Evolution in Mice by Expression of a Selected EDAR
Variant
Selected East Asian EDAR allele, 370A, emerged in central China ∼30,
000 years ago
Hair, sweat, and mammary glands are altered in a 370A knockin mouse model
The novel effect of 370A on mouse sweat gland density is recapitulated in
humans.
美女教授 pardis-sabeti 本期Cell连续两篇 |
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o**4
发帖数: 35028 | 18 我想给某个基因加上GFP的marker，用这个技术可以么？
据说这个东西特别贵？ |
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b******k
发帖数: 2321 | 19 现在已经没必要再搞ZFN了 TALE的精度和效率都好得多
要KI的话没有直接的办法，至少目前没有。但是也有几个组报道可以先KI个段序列，
loxP/FRT/AttP这种 然后再插入就容易了 |
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o**4
发帖数: 35028 | 20 用TALE的话，最多能插入多大的片段到基因组呢？
用这个技术加个Flag tag之类的可行吗？ |
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A****A
发帖数: 16 | 21 物种不同难度也不同。TALEN自己做不贵。
可以参考最近的Zebrafish的文章
Nature Methods | Brief Communication
TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in
zebrafish
Nature Methods
(2013)
doi:10.1038/nmeth.2374 |
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A****A
发帖数: 16 | 23 给你篇review看看：
Nature Reviews Molecular Cell Biology 14, 49-55 (January 2013) | doi:10.1038
/nrm3486
TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing
J. Keith Joung1 & Jeffry D. Sander1 |
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a***o
发帖数: 129 | 25 可以，你好好看看最近那几篇crispr有关的paper。 两篇Nat biotech， 两篇Science
，还有一篇cell，都是今年发表的，hot hot hot |
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a***o
发帖数: 129 | 29 他下手比较快，不过idea是从Charpentier那抢来的，也不是什么太光彩的事。不过也
不知道Charpentier在等啥，据说去年夏天开会时就说就已经有genome editing的data
了，结果现在悲剧了。 |
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a***o
发帖数: 129 | 30 人家开会听了一耳朵，半年就发了science，您我就不说啥了，呵呵。 |
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z*t
发帖数: 863 | 31 问个问题哈，talen切割后不是通过引入的片段同源重组来edit genome么？
楼主若是相加个gfp在同时转针对特定序列的taln + 两侧用同源片段flank的GFP
plasimid就可以了？ |
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f**u
发帖数: 346 | 32 我记得在哺乳细胞里面已经做到用GFP去tag内源蛋白了，
忘了是ZFN还是TALEN了，不过应该差不太多吧。
其他物种好像还没看到。 |
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f**u
发帖数: 346 | 33 理论上是这样，但是已经发表了的成功例子寥寥无几。
也许今后一段时间会井喷吧。 |
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s******r
发帖数: 1245 | 34 这些方法就是在想要的位点切一刀，用剪刀，水果刀，杀猪刀反正只要把dna切断了，
之后的都是同源重组，没有区别 |
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w********r
发帖数: 1431 | 35 谢谢review
只是大概扫了一眼Zhang Feng的paper，没有仔细挖这个的进展
喽 |
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z*t
发帖数: 863 | 37 我印象中David Allis group用GFP tag过H3.3。是不是indel的关系？
Caspir的indel在feng zhang那篇paper看起来还是挺明显的。 |
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a***o
发帖数: 129 | 38 赞，还以为charpentier 和 doudna 是一伙的，总算明白了。 doudna的human cell
study发在elife只有寥寥四五个图，相比church和张的，被scoop也在情理之中。 |
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b******n
发帖数: 4225 | 39 你牛，一个机器人的帖子还看出门道来了
magazine |
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m**e
发帖数: 857 | 40 Kao, Zhang Feng is SO BULL!!
He is from Deisseroth lab with lots of optogenetics bull paper, then go for
genetic editing area with bull paper.
I am wondering how he learn to pick labs, he must have a huge sense of
science. |
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l**********1
发帖数: 5204 | 41 sure :-)
btw,
bulletin (bulletin)
one ask:
recently discrete math or combinatorial math? applied in Comp Biology?
which is better? for stochastic and deterministic human neural circuit?
what is your suggestion/opinion?
reference:
同主题阅读：Re: 请教一下CS的同学，组合数学和离散数学有什么区别？ (转载
[版面:数学][首篇作者：Aciclovir] , 2008年07月13日16:00:53
0
[ 1 ]
发信人: Aciclovir (笨笨), 信区: Mathematics
标 题: Re: 请教一下CS的同学，组合数学和离散数学有什么区别？ (转载)
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Jul 13 16:06:24 2008), 转信
侧重点不一样，本质上都在讲同一个东西
combinatorial math and dis... 阅读全帖 |
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o**4
发帖数: 35028 | 42 我想给某个基因加上GFP的marker，用这个技术可以么？
据说这个东西特别贵？ |
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b******k
发帖数: 2321 | 43 现在已经没必要再搞ZFN了 TALE的精度和效率都好得多
要KI的话没有直接的办法，至少目前没有。但是也有几个组报道可以先KI个段序列，
loxP/FRT/AttP这种 然后再插入就容易了 |
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o**4
发帖数: 35028 | 44 用TALE的话，最多能插入多大的片段到基因组呢？
用这个技术加个Flag tag之类的可行吗？ |
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A****A
发帖数: 16 | 45 物种不同难度也不同。TALEN自己做不贵。
可以参考最近的Zebrafish的文章
Nature Methods | Brief Communication
TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in
zebrafish
Nature Methods
(2013)
doi:10.1038/nmeth.2374 |
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A****A
发帖数: 16 | 47 给你篇review看看：
Nature Reviews Molecular Cell Biology 14, 49-55 (January 2013) | doi:10.1038
/nrm3486
TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing
J. Keith Joung1 & Jeffry D. Sander1 |
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a***o
发帖数: 129 | 49 可以，你好好看看最近那几篇crispr有关的paper。 两篇Nat biotech， 两篇Science
，还有一篇cell，都是今年发表的，hot hot hot |
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