w********u
发帖数: 5457 | 1 最近头都大了，要在老鼠的cell line里面过表达和knockdown一个gene，选了L929细胞
，觉得挺简单的试验，结果两个礼拜下来，杯具了。
先是knockdown，试了siRNA pool和shRNA plasmid （4 clones），均没有knockdown效
果。重新design了shRNA，准备再试。
又做了overexpression，openbiosystem买的construct，CMV promoter （pCMV－
SPORT6 plasmid），CDS测过序列，完全正确。转染了，western blot，又啥也没有高
表达。转染效率40％－50％。
目标基因是个胞质胞核穿梭蛋白，结合RNA，功能重要但研究文献不多，表达量各个细
胞不均一，但是knockout老鼠胚胎很早死亡，无KO老鼠。
请教有经验人士，可能是啥原因？是不是L929这个细胞朱就是不容易搞啊？如果是，有
啥别的老鼠细胞容易搞的？或者还是有别的可能？
谢谢拉！ |
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n***3
发帖数: 663 | 2 If you start with just a little L929 cells, when they grow to 90% confluence
, remove the culture medium (throw away) and split the cells at 1:2 ratio
into new flask. Then, these cells will grow to 90% confluence every one day.
This time you can collect the culture medium as your "conditioned medium"
for BM cells.
Culturing L929 cells for "7" days without changing medium is not a good idea
. No matter how many cells you start with, at least change the medium every
3 days. |
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n***3
发帖数: 663 | 3 有多少细胞飘着？一般情况下是flask都长满了，没有多余的地方贴壁的情况才会有少
量细胞飘着。
做conditioned medium的时候飘着的细胞应该是BM cells。 我一般在配conditioned
medium以后最后一步过滤一下，去掉floating L929 cell. |
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d****i
发帖数: 2346 | 4 说实话，头一回碰到你说的这个办法，理论上是很不错的。但是我搜索了很久都没人提
到这个办法，有文献吗？不想自己去test了，可行的话我就直接这样做了。谢谢！！！
If you start with just a little L929 cells, when they grow to 90% confluence
, remove the........ |
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l*********1
发帖数: 2971 | 5 核心提示：邢利斌第一桶金来源于租赁经营的柳林县金家庄乡办煤矿，随后其以8000万
元的“白菜价”获得了储量15亿吨国营企业柳林县兴无煤矿的全部股权，进而一跃成为
山西柳林首富，目前资产超百亿元。
陆晓辉
21世纪网 一场盛大的婚礼使一向低调的山西柳林首富邢利斌名闻天下。
3月18号，联盛集团董事长邢利斌在三亚为女儿举办大型婚礼，并开演唱会，婚礼总费
用超过7000万元。煤老板的奢华再次震惊了普通民众。
21世纪网调查发现，邢利斌第一桶金来源于租赁经营的柳林县金家庄乡办煤矿，随后其
以8000万元的“白菜价”获得了当地最大、储量15亿吨的国营企业柳林县兴无煤矿的全
部股权，进而一跃成为山西柳林首富，目前资产超百亿元。
煤老板的奢华嫁女婚礼
2012年3月18日，三亚，山西柳林首富、联盛集团董事长邢利斌山为女儿婚礼专门开的
一场群星演唱会，会场嘉宾都来自山西本地和全国的知名人士，还有国际嘉宾。
据悉，演唱会请来了诸多明星助阵。朱军、周涛主持，王力宏、萧亚轩、陈佩斯、朱时
茂、冯巩、韩红、殷秀梅、范玮琪、宋祖英、周杰伦、飞轮海、李玉刚、阎维文、游鸿
明等人则现身表演。
人民网的消息称：邢利斌... 阅读全帖 |
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g*******0
发帖数: 3240 | 6 这几个人都非常牛逼的.
茅以升是卡梅的第一个博士,不是第一个中国博士.
建成的钱塘江大桥在1937年那也是世界级水平.
吴有训在芝大的博士论文实验验证了康普顿效应
吴宪是MIT本科,哈佛博士,
在l929年的第13届国际生理学大会上首次提出了蛋白质变性理论.
生物化学本科生教科书的必须涵盖的内容.
林可胜是爱丁堡大学医学本科和博士(英国医学首屈一指的学校)
第一个提出并实验验证镇痛有中枢和外周的区别
1942年，当选为美国科学院外籍院士，1955年为美国科学院院士.
(美国科学院第一个华人外籍院士和第一个华人院士) |
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y***u
发帖数: 7039 | 7 一、言论自由
１９２６年３月，李大钊在极端危险和困难的情况下，积极领导并亲自参加了北京反对
帝国主义和北洋军阀的三一八运动，号召人们用五四的精神、五卅的热血，不分界限地
联合起来，反抗帝国主义的联合进攻，反对军阀的卖国行为。遭到北洋军阀的仇视，他
们下令通缉李大钊。
大钊备受酷刑，在监狱中，在法庭上，始终大义凛然，英勇不屈。四月二十八日，凶残
卑怯的敌人不顾广大舆论的反对，将大钊和谭祖尧、邓文辉、谢伯俞、莫同荣、姚彦、
张伯华、李银连、杨景山、范鸿劼、谢承常、路友于、英华、张挹兰、阎振三、李昆、
吴平地、陶永立、郑培明、方伯务共二十人（其中多数是共产党人，也有国民党人）一
齐绞杀。
二、游行、示威自由
1925年5月30日，数千名工人、学生、群众到上海公共租界各条马路组织大示威，抗议
日商内外棉纱厂资本家无理枪杀工人顾正红，要求释放因声援工人罢工而被捕的学生，
反对公共租界工部局的印刷附律、增加码头捐、交易所注册等4提案。下午，大量学生
聚集到租界内最繁华的南京路，其中有100多人被捕，关押在老闸捕房。到下午3时，约
有上万群众涌到老闸捕房门前进行交涉。下午3时55分，英国籍捕头下令向... 阅读全帖 |
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d****i
发帖数: 2346 | 8 显微镜底下看也不像是死的，是不是贴壁不牢固？fiberblast细胞贴壁为啥不牢固呢？
做conditioned medium的时候7天后上面漂了一层。。。
请大神指点哈。谢谢了！ |
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d****i
发帖数: 2346 | 9
做conditioned medium那一步还没到BM细胞那里呢。。。 |
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n***3
发帖数: 663 | 10 没有文献（不知道有没有），这个是我个人的经验，up to you.
confluence |
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