b*****n
发帖数: 1841 | 1 用Lenti Virus感染细胞，第一二代效果非常好，过表达的达到几百倍，Knock down的
达到90%的效率。但是传了三四代之后，过表达的只有几倍了，而knock down的几乎没
有看到效果。
Lenti virus同时携带GFP，可以看到传过几代之后，GFP还在，但是亮度大大下降。
以上的细胞还经过GFP的sorting后传代。
版上各位有否碰到类似的现象？如何解决？ |
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l******e
发帖数: 125 | 2 想把一段promoter+GFP克隆到retro or lenti virus vector里面，这样的话就要找到
没有启动子的vector。请有经验的高人指点。多谢！ |
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f*********6
发帖数: 94 | 3 想immortalize人的原代细胞，用了pBabe-hygro-htert。折腾了有段时间了，却没拿到
cell line.想有个tag会显示转染效率。有lenti的就更好了。请问那位能给我匀一点？
请站内联系。谢了先。 |
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a*******a
发帖数: 4233 | 4 一般我用lenti都不做stable line，除非有生长优势，否则很容易丢掉。 |
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g*******r
发帖数: 129 | 5 htscorpion: Lenti is an RNA virus...
Maybe the ssRNA genomes are more flexible than dsDNA counterpart, and
there are proteins to pack these RNAs? |
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c****1
发帖数: 1095 | 6 有人做过lenti-CRISPR么？有没有同时用两个gRNA的？好像没看到这方面的文章。
是不是最好一个U6，一个H1？有没有现成的质粒？
多谢！！ |
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i*****i
发帖数: 154 | 7 第二点，在表达载体上，第二代表达载体采用野生型的 HIV的LTR，而第三代载体采用
了chimeric的LTR，所以你经常会看到第三代表达载体的LTR写成CMV/LTR或者RSV/LTR用
来表示这种杂合LTR结构。
无论是lenti还是retro，LTR都既是promoter又是enhancer，比较一下lenti和retro的
LTR差别还是非常大的。
其实我们试过，lenti的包装系统可以包装retro的，而retro的也能包装lenti的表达载
体，只是效率非常非常的低，没有实际的可操作的意义，还不如直接用pcDNA3.1感染呢。
lenti里的特殊结构
WPRE (Woodchuck
Posttranscriptional Regulatory Element) from the woodchuck hepatitis
virus, increases transgene expression.
cPPT (central Polypurine
Tract) from the HIV-1 integrase gene, increases the copy number o... 阅读全帖 |
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n********k
发帖数: 2818 | 8 no, it seems u need to do a better homework:))...the packing systems for
lenti and retro are the same except lenti need one extra...the difference is
lenti vector has the bosai element which determine the nuclear import...
that's why lenti can infect both dividing and non-dividing cells...frankly,
I haven't seen any retro which doesn't infect non-dividing at all... |
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b********r
发帖数: 31 | 9 lenti本身不会再复制，但不等于它没有危险。这个lenti的危险性就我的理解是这样的，
1.它之所以强大，是因为它比别的病毒要容易感染宿主细胞。一般病毒只感染活跃复制
的细胞；而lenti可以感染不在复制的细胞。
2.感染后，lenti所携带的基因可以插入到host genome里面去，而这个integration的
位置是相对随机的。要是不幸被integrate到某个重要的位置去，引起mutation也不是
不可能的，不论它携带的是啥玩意儿。更不要提如果它carry的是oncogene了。
但它是RNA病毒，相对也比较脆弱，酒精和bleach和UV可以将其杀死。
只是操作的时候，还是要小心再小心。 |
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S*********s
发帖数: 304 | 10 用过lenti/retro
感觉表达差不多，基本要2-3天。
lenti titer比较高 > retro.
两者包装的片段大小都有限，<80KD, 再大一点的蛋白对病毒滴度影响很大，一般需要
浓缩。
retro 较 lenti安全一些。包装retro的时候可以选择pCL-Eco, pCL-Ampho,etc等
不同的外壳蛋白。pCL-Eco只能介导感染mouse cell,在做oncongene的时候尤为重要。
你不希望用个EGFR mutant or K-Ras mutant的lentivirus 去感染你的小鼠or细胞，一
旦泄露，有oncogenesis的风险。
另外retro只感染分裂的细胞，生长很慢的细胞用retro感染效率很低。
另外从整合到基因组上的位点来看，lenti有 hotspot，retro更倾向于插入
transcription active的region。所以很多random mutagenesis是retro based的。
Adeno没用过，据说插入基因的size可以更大，但做载体比较麻烦,没经验。 |
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r***e
发帖数: 2539 | 11 如果你的问题是：一个已经整合了lenti-vector的293T细胞，再转进packaging mix，能
不能自己produce virus?
这个肯定不行的。你仔细看下lenti vector的结构就知道了，vector是有external pro
moter能转录整个viral RNA，而整合以后的片段不行。这也是safety的设计， 在第三代
lenti viral vector的LTR自己没有转录活性了，叫做self inactivated。
if |
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j******i
发帖数: 939 | 12 Gamma-retrovirus and lenti are both efficiently transduced into cells, but
gamma-retro can not infect non-dividing cells. Both Gamma-retro and lenti
insert into genome and thus have insertional mutagenesis risk, however,
gamma-retro usually inserts into transcription start sites and more likely
to disrupt genome gene expression. Lenti virus, however, is sort of safer
virus with no preference to start point while inserting.
Adenovirus is episomal virus and can only infect dividing cells. This mea... 阅读全帖 |
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j****x
发帖数: 1704 | 13 Adenovirus以及基于Adenovirus的重组载体显然可以有效的感染分裂及非分裂细胞，这
也是AdV载体的一个显著优势之一。
AdV是一种相对安全的载体系统，主要原因有几个方面：
1. AdV本身是一种广泛存在的低致病性病毒，大部分人都有一定的免疫力。
2. 只感染，不整合，致癌性低。这点相比retro/lenti-viral vector自然安全性高一
些（当然，也因为不整合，不能长期稳定表达，这是相比lenti的一大劣势） 。
3. 作为疫苗和基因治疗载体已经在临床实验中广泛使用了很多年
而Lentiviral vector目前也已经发展到了第3代第4代了，实验室安全性也相当好，但
是由于基因治疗应用中必然存在的这样那样的风险，必须尽百分之一万的努力去消除哪
怕那百分之零点零一的可能性，而且之前也有多次失败的教训，所以lentivector乃至
基因治疗这个领域至今始终无法再更进一步。也许在未来载体系统的基因组定点整合能
够实现的话，整个领域能够有所突破，这个显然将会是革命性的。
anyway，实验室操作无论是retro/lenti还是AdV系统，都必须严格在BSL-2级别... 阅读全帖 |
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z*****g
发帖数: 306 | 14 NO oncogene into Lenti-X -- please read Clontech's mannual. Never oncogene.
BioSafety Level II is for Lenti-X and cell culture. After packaging, the
virions are in the dish or freezer. It should be safe.... I made 3 Lenti |
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s******y
发帖数: 28562 | 15 谢谢！
我从来没有用过lenti, 所以都不知道有这种差别。受教了。
另外，为什么retro vector 不能装进lenti 系统里面呢？难道他们的包装
信号差的很远么？
我一直误认为lenti就是多了一个强行进入细胞核的蛋白，这么看来还是有
别的差别？ |
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j******i
发帖数: 939 | 16 那就是感冒了呀 lenti还是比较安全的 都用来做过基因治疗了 那可是大剂量注射的
lenti的潜在危险在于插入到oncogene附近 启动oncogne 或者打乱tumor suppressor
但是目前没有致癌的案例 HIV感染也没有明显的癌相关呀 但是实验室用lenti表达
oncogene的话 要加倍小心 |
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K**R
发帖数: 193 | 17 我觉得adeno 快些吧，lenti 咋说还的整合到chromosome里。 另外应该是lenti，比
如retro安全吧，可能titration低一点？ lenti是retro 替换性产品，应为我当时当
销售买过的。 |
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j******i
发帖数: 939 | 18 基因治疗上lenti取代retro是个趋势 最主要的是安全性 因为retro偏向查到
regulatory region 因此激活癌基因的可能性大 所有的retro引起白血病的例子就是这
个原因 而lenti喜欢查到基因里边 因而激活癌基因的风险小 当然随之而来的是打乱基
因正常的splicing 目前基因治疗还没有lenti引起白血病的例子 |
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a*******a
发帖数: 4233 | 19 用lenti会比较好，因为lenti不是从单细胞来的，所以能排除单克隆基因型不稳定及目
的片段特异插入带来的问题。
基因比较大还是载体比较大？pc3.1大概5k,也就是说你的目的基因3k大，lenti还是放
得下的。如果是你的目的基因就7k，那就麻烦了
搞不好瞬转表达也有问题。 |
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a****l
发帖数: 125 | 20 我要knockdown 的蛋白对cell proliferation 很重要。害怕用lenti-shRNA 后细胞不
长了。所以想用transient 的siRNA. 但具体Lenti-shRNA 会不会造成这种后果也不清
楚。还请在坐赐教。 |
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p******d
发帖数: 3737 | 21 按照操作规则就应该没有问题。本身lenti就已经把病毒的成分分散在多个质粒体系中
了，出现感染性变异的可能性就非常非常小了。加上严格的操作隔离，是不会有问题的
。当然，建议你在做之前，把lenti的操作规则熟悉清楚，包括个人的防护，废物废液
的处理等等。 |
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r***e
发帖数: 2539 | 22 对于lenti vector，transfection能表达，但infection不表达的话，可能是
1. 质粒重组掉了一段序列（在Lenti载体中经常发生），影响你的蛋白表达。
2. transfection可以用external promoter，而infection以后只能用internal promot
er。
GFP |
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c****y
发帖数: 14 | 23 Hi, reuse,
对于lenti vector，infection后整合到染色体上，应该还是用CMV promoter, 对吗？
因为这儿没有internal promoter.
infection后可能质粒重组掉了一段序列（在Lenti载体中经常发生），影响你的蛋白表
达。请问如何避免这种情况发生？
谢谢！ |
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r***e
发帖数: 2539 | 24 Thank everyone for the discussion!
As pineseed pointed out, too many topics were discussed here.
But my personal interests are:
1. what is the cell origin of different type of lung cancers?
2. does cell origin or mutation decide tumor types?
3. how to model different type of lung cancer?
HGTPase, it seems you are working in this field (more lung development than
lung cancer?), and I hope you can give your opinions. We can also discuss in
private mails for technique details.
1. ... 阅读全帖 |
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L**********O
发帖数: 1761 | 25 I have done lenti..
why is lenti better than retro? |
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j******i
发帖数: 939 | 26 Of course lenti belong to retrovirus family! ; ) Just because when people
say retrovirus they actually mean
gammaretrovirus. And for lenti, it is just a name to make HIV1 virus looks
not that horrible ; ) |
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C******r
发帖数: 790 | 27 哪种方法好转染？磷酸钙，PEI，Fugin6, Lipo2000, Lipo-plus？
或者都不容易转染？就只好硬着头皮再一个一个往lenti-vector里装。MEF是否比较容易
被lenti感染？
Thanks for answer. |
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d******u
发帖数: 178 | 28 非要transfection的话，DreamFect，但毒性比较高。比前面列的效率都高。
Lenti和Retro都可以，如果有selection的话不用太担心效率。Lenti在我手上一直work
很好呀，连照过的feeder cell都转得进去。 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 29 唯一可靠的就是rescue试验...
兄弟你有可靠的lenti vector for cDNA吗？
装了一堆lenti质粒就没有一个能表达蛋白的...
shrna |
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m******n
发帖数: 121 | 30 问一下，可以用rt-pcr测ltr的方法检测lenti的滴度吗？另外这个方法怎么样呀？主要
是我有一个lenti没有gfp，然后p24的试剂盒么又太贵，所以在考虑用rt-pcr测滴度。
。。。。 |
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s*****i
发帖数: 315 | 31 Ubiquitin Promoter，EF1a promoter,
对于老鼠细胞系来说lenti和retro都能感染，不过感染了lenti之后就不能感染retro了
，反之则可以。 |
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s*****i
发帖数: 315 | 32 Ubiquitin Promoter，EF1a promoter,
对于老鼠细胞系来说lenti和retro都能感染，不过感染了lenti之后就不能感染retro了
，反之则可以。 |
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C********4
发帖数: 308 | 33 我前四五天做了lentivirus，过表达一个蛋白。当然我按操作规则做了。但是那个P2
lab很脏乱，谁知道别人是不是很小心。
结果这两天出现了流感样症状。是感冒了，还是被lenti感染了？
lenti感染会是啥症状？ |
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h********n
发帖数: 4079 | 34 理论上说, 完整的皮肤不会被感染.
退一步说, 即使有少量细胞被感染, 因为你用的是replication defect lenti, 所以感
染不会扩大.
另外, 要看你的lenti里面表达了什么基因. 如果你表达Kras + cMyc, 如果感染成功,
估计可以长cancer. 等长出来了, 切下来, 做个表征, 在搞出个human cancer cell
line, 用你的名字命名, 至少可以发一个nature medicine. |
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a*******a
发帖数: 4233 | 35 我们也是这么做的。
而且。。lenti的感染力很差，专门浓缩了病毒做小鼠大脑的原位注射无法感染小鼠。
。。
当然lenti对人源宿主的感染能力可能要强一点
um |
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a****d
发帖数: 1919 | 36 个人经验， lentivirus （ubiqutin promoter） 感染的细胞，12小时后可以看到eGFP
表达。 CAG-CMV promoter based lenti也能很快看到外源基因表达。
我培养的原代细胞，D0用lenti处理，D3 固定染色，没有问题。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 37 谢谢！Lenti比retro 安全一点点而已（致癌性不强）。替代的主要原因应该是因为
Lenti可以感染不分裂的细胞吧？ |
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j****x
发帖数: 1704 | 38 其实并不麻烦，在Lenti系统推广之间大家都是这么干的，现在也仍然有很多人在用，
主要的缺点就是在难转染的细胞系上不好整，如果转染效率不是问题，筛克隆其实不比
Lenti系统更复杂 |
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O*****l
发帖数: 97 | 39 干嘛这么麻烦，用CRISPR质粒 （px330系列）transient表达Cas9和gRNA，同时转两个
，KO效率还是很高的。
如果要做整合，用lenti表达Cas9, 再转入gRNA就是了。不过lenti-Cas9的titer较低，
整合效率不高。 |
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j******i
发帖数: 939 | 40 皮肤用lenti很容易感染 不过老鼠的皮肤比较薄 注射有点难度 你的lenti滴度不高啊
没有超离心吧 |
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v*******n
发帖数: 8995 | 41 是有什么特殊的g protein么？
哥提取的肺部的细胞 用lenti 也就是vsv g
转化的效率很低
用这个冠状病毒的g 蛋白也许可以解决这个问题
这下nature biotech跑不掉了 法克也
★ 发自iPhone App: ChinaWeb 1.1.5 |
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w**y
发帖数: 687 | 42 今天看了另外一个mm的帖子，我更加纠结了。
我也是做生化的,除了有毒试剂，
我们老板还想要我做病毒...我直接拒绝了~
AAV 和 lenti virus...
不是只是用一下，而是大量的packaging 和 purification。
虽然老板说不用我做，可是别人做用的hood什么，我也是要用的啊...实验室就那么小.
..
我真的很纠结啊...感觉很对不起宝宝... |
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w**y
发帖数: 687 | 43 今天看了另外一个mm的帖子，我更加纠结了。
我也是做生化的,除了有毒试剂，
我们老板还想要我做病毒...我直接拒绝了~
AAV 和 lenti virus...
不是只是用一下，而是大量的packaging 和 purification。
虽然老板说不用我做，可是别人做用的hood什么，我也是要用的啊...实验室就那么小.
..
我真的很纠结啊...感觉很对不起宝宝... |
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r*****m
发帖数: 231 | 44 I did... also did Lenti
my baby is healthy :) |
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C*********n
发帖数: 150 | 45 有一朋友年底将以特聘教授海龟苏州大学，现寻找实验室助理一名，根据自身条件可聘
为苏州大学讲师或副教授。专业是生物医学。有分子生物学，动物模型（小鼠），病毒
(Lenti virus, etc)，神经生物学背景者优先考虑。有意者请站内联系。 |
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d*p
发帖数: 534 | 46 这几年一直在做高通量的shRNA筛选，感觉现有的产品有很大缺陷，想开发以下产品：
现在做功能研究比较快,能够进行高通量的就是knockdown and over-expression 这两
种方法。因此想做下面两类产品：
1， 覆盖全基因组的shRNA和siRNA， 每个基因两条， 每条的knockdown效率经过验证
，保证大于80%，提供蛋白水平的knockdown结果。
2， 覆盖全基因组的cDNA表达库，克隆每个基因的cDNA到Lenti-vector, 带上Barcode。
算了一下成本，用我的方法，大概5m 美元能够做完人和小鼠的这两个库，Broad现在也
在做，但是他们的方法效率太低，结果还非常不可靠，按他们的方法，50m都不够。
完成以后,
1. 可卖单个基因的产品，和市场上的公司竞争，全球市场大概有5亿美元左右的市场。
目前市场上的shRNA基本都是卖几个给你，不知道那个有用，有时候一个有用的都没有
，或者knockdown太低，看不到表型，需要自己花时间去验证。
2. 全基因组的knockdown 和over-expression library完成后，每个基因有两... 阅读全帖 |
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g**********2
发帖数: 2408 | 47 不知道你们看的新闻是怎么说的，但我想大概说的是Lentivirus。HIV 属于Lentivirus
的一种，用lenti virus转基因效率非常高。很多基因治疗的临床试验都用到它们。原
因很简单：通过进化，它最拿手的就是将基因转到动物细胞体内。适者生存么。
但是这些virus 已经经过改造，所以并不致病。
打个比方：
有个强盗很会撬锁（侵入细胞），警察学会了他的撬锁技术，但是用来救人。 |
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w*****t
发帖数: 179 | 48 您好，不知道我的背景能否审到这片文章。我曾经审过一些小杂志，希望能够对我争取
这次机会有所帮助。详细的CV和研究背景如下。非常感谢您的考虑。我的工作邮箱：
z****[email protected]
好像CV在这里粘贴很难看，不好意思。前一段时我的CV，后一段我的较详细的研究经历
。如有需要我更详细的背景情况，请跟我发信。
1
CURRICULUM VITAE
Full Name: Zhimin Wang
Address: Allegheny-Singer Research Institute, West Penn Allegheny, Health
System, South Tower, 320 East North Avenue, Pittsburgh, PA 15212-4772
Phone: 412-359-6153 (Office)
412-737-3777 (Cell)
E-mail: z****[email protected] w************[email protected]
EDUCATION
September, 2001- May, 2005 Ph.D., Molecular M... 阅读全帖 |
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w*****t
发帖数: 179 | 49 hello, thank you for providing the information. Please find my CV below and
my research experience. I have been revewing for over 10 journals for 14
times. My majour of PH.D is microbiology from Wuhan university. I have
published several papers concering virology and bacterial infection. So far
my work also foucse on salivary gland biofilm formation under LL37 and K4s4
treatment. If you need further information, please let me know. My email
address: z****[email protected]
Thank you for your time and c... 阅读全帖 |
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A********y
发帖数: 73 | 50 from last year's anouncement:
In a good year, over 2 dozen beautifully arranged tables of carefully picked
, identified, and displayed wild, locally foraged mushrooms are presented fo
r the public. This colorful event also showcases mushroom cookery and preser
vation, toxic mushroom information, books and posters for sale, demonstratio
ns of dyeing with mushrooms, a truffle exhibit, mushroom themed art, a "Kids
Corner", medicinal mushroom information, and cultivation of mushrooms, incl
uding "gr... 阅读全帖 |
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