r*****t
发帖数: 4793 | 1 自己偷偷做的东西，因为老板不喜欢
一个蛋白A，调节转录。可以和另一蛋白B结合。
偶然发现，A的突变体a(仍然可以结合B），导致细胞中B蛋白减少。这种调节不是转录
水平的，因为RT-qPCR和RNA-seq都表明，A和a都不带来B基因转录的明显变化。
考虑是蛋白降解水平的调节，用MG132 处理也确实发现，a不再导致B的下降。可是B蛋
白水平的恢复并不伴随其泛素化的增加。试着看了看是否a改变B与某些E3 ligase的结
合，结果也不理想。
不知道怎么做下去了。还不能问老板，it对我这个小项目一点都不喜欢。shit |
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d****d
发帖数: 214 | 2 果真如此，看以下四篇文章的题目就知道是一个套路的。而且每篇文章都有共同第一作
者。
Cui J, Li Y, Zhu L, Liu D, Songyang Z, Wang HY, Wang RF. NLRP4 negatively
regulates type I interferon signaling by targeting the kinase TBK1 for
degradation via the ubiquitin ligase DTX4. Nat Immunol. 2012 Mar 4;13(4):387
-95.
Ajibade AA, Wang Q, Cui J, Zou J, Xia X, Wang M, Tong Y, Hui W, Liu D, Su B,
Wang HY, Wang RF. TAK1 negatively regulates NF-κB and p38 MAP kinase
activation in Gr-1+CD11b+ neutrophils. Immunity. 2012 Jan 27;36(1):43-54.
Xia X, Cui ... 阅读全帖 |
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L****e
发帖数: 499 | 3 ChIP 有的好做很容易就做出来，有的很难，最关键的是抗体要好。我最近一个用常规
方法怎么都做不出来，后来用了一种 biotin ChIP, 就是将目的基因和一种 biotin
ligase 同时表达，让目的基因biotinated, 然后用streptavadin dynal bead 做ChIP
，这个biotin 最大的好处就是非常特异。你不妨试一试 |
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L****e
发帖数: 499 | 4 ChIP 有的好做很容易就做出来，有的很难，最关键的是抗体要好。我最近一个用常规
方法怎么都做不出来，后来用了一种 biotin ChIP, 就是将目的基因和一种 biotin
ligase 同时表达，让目的基因biotinated, 然后用streptavadin dynal bead 做ChIP
，这个biotin 最大的好处就是非常特异。你不妨试一试 |
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C********4
发帖数: 308 | 5 还有，要知道，做ChIP的话，你的蛋白必须是个通过绑在chromatin发挥功能的蛋白，
比如转录因子，coactivator／repressor，而不是其他的，比如kinase，在signaling
里面发挥功能，或者E3 ligase等等，不进基因组和染色体。 |
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z*h
发帖数: 773 | 6 Simple Cloning: direct transformation of PCR product (DNA multimer) to
Escherichia coli and Bacillus subtilis
We developed a general restriction enzyme-free and ligase-free method for
subcloning up to three DNA fragments into any location of a plasmid. The DNA
multimer generated by prolonged overlap extension PCR was directly
transformed in Escherichia coli [e.g., TOP10, DH5α, JM109, BL21(DE3)] and
Bacillus subtilis for obtaining chimeric plasmids.
http://aem.asm.org/content/early/2011/12/16/AEM... 阅读全帖 |
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b*******r
发帖数: 18 | 7 我做的东西偏重cell-based assay，比较传统的信号通路领域。长久以来对于自己的数
据，
总有一种怀疑的态度。每次拿到一个数据的时候，首先想到的是：这个数据是真
的吗？
举个例子，前段时间大家讨论过PTEN E3 ligase，已经有文章证明NEDD4-1不是。就在
这错误的基础上，不断有文章出来，甚至还是cancer cell （Rak Functions as a
Tumor Suppressor by Regulating PTEN Protein Stability and Function）。如果这
个课题给我来做，肯定做不出来，也不会发到这个上。
我仔细想了一下，可能和自己的经历有关。phD的时候，有个课题老板逼的紧，我随便
做了一下，告诉了他一个结果。后来有人接着做，居然做出来还发文章了，文章还不错
。博后的时候，一个很偶然的机会，发现老板发在molecular cell上的文章是错的，这
个试验很简单，用drug处理一下，然后run WB,怎么可能得到和我相反的结果呢？一
年前申请过一个fellowship，因为觉得数据不可靠（老鼠上的结果不支持CELL DA... 阅读全帖 |
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g*****n
发帖数: 250 | 8 1.跑胶clean-up会污染什么东西，抑制ligase. PCR products只好跑胶clean-up (
Qiagen kit). 载体就不必了.
2.酶切位点外要多出３-５个核苷，以确保酶切。
3.如果用的是Taq，酶切位点突变（可能性极小）。
TA也不成，看来２，３都不大可能是问题。但是，不妨考虑。
试试TA TOPO。然后再切下来装到你要的载体上。 |
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d**********9
发帖数: 981 | 9 多谢大家帮忙了，我在发帖之前自己也试过很多办法，但是都没有解决问题：
1.我试过在作1500bp片断连T载体的同时，作500bp片断的连接，没有问题，是不是
1500bp片断还是很难连很多？
2.本身我的酶切位点外多５个核苷，应该直接酶切没有问题
3.试过不同公司的ligase，但是transform之后都没有克隆
4。试过不同公司的感受态细胞，但是都没有克隆，对于单纯的质粒，能长克隆，可见
感受态细胞和LB板应该没有问题
5.没有试过不用CIP,接下来要试试
虽然所有的试剂都是到了新的实验室刚买的，但是也都是以前一直用着的。原来觉得实
验很简单，但是一直没有出东西，郁闷！ |
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b******n
发帖数: 4225 | 10 你的引物得在合成的时候让公司给5'端加磷酸
否则一般的Ligase没法连上
ligation |
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e****s
发帖数: 1125 | 11 过表达蛋白发生高度的泛素化是很正常的。
很多E3 ligase自身泛素化，他们的底物也会有这一现象。
我做的蛋白起码有3个有类似现象。 |
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C****n
发帖数: 79 | 12 不知道你解决了没有。
昨天做了一个类似的，只不过我是5k + 5k
I assume 你gel extraction是干净彻底的
我用的molar ratio 是1:1，我不知道你为什么要用3:1或者其他的。为什么一定要认定
一个是insert，而另一个是plasmid呢，为什么不能换一下？
我用的是NEB的普通T4 DNA ligase， 连接1小时（普通的我一般是连接20min，也值按
照Protocol上说的），因为片段比较大。
I assume 你的感受态是没有问题的。
最后我提醒一下你，有时候酶切验证会失败，原因是不你克隆失败，而是其他原因，比
如甲基化。
Touble-shooting一下，不要漫天考虑太多的因素。
Hope it helps. |
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x*****e
发帖数: 309 | 13 看来做cloning 的人还真不少，其实我建议不要纠结于连接了。设计PCR得到5+5=10kb
的片段，注意设计引物的时候5端磷酸化修饰，然后直接T4 ligase连接 10 kb的片段，
相当于自连，容易很多，PCR酶可以用NEB的fusion，说明书上说可以扩增22kb的片段。 |
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z*********s
发帖数: 38 | 14 Essays Biochem. 2005;41:15-30.
E3 ubiquitin ligases.
Ardley HC, Robinson PA.
Source
Molecular Medicine Unit, University of Leeds, Clinical Sciences Building, St
. James's University Hospital, Leeds LS9 7TF, UK.
十分感谢：
E-mail:y**********[email protected] |
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n**********u
发帖数: 77 | 16 Coenzyme A ligases involved in anaerobic biodegradation of aromatic
compounds 1995
A thiamin diphosphate binding fold revealed by comparison of the crystal
structures of transketolase, pyruvate oxidase and pyruvate decarboxylase
1993 |
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y*j
发帖数: 200 | 18 E3 ubiquitin ligase Cbl-b in innate and adaptive immunity
By: Liu, Qingjun; Zhou, Hong; Langdon, Wallace Y.; et al.
CELL CYCLE Volume: 13 Issue: 12 Pages: 1875-1884 Published: JUN 15
2014
pls send to [email protected]
(function(){try{var s,a,i,j,r,c,l,b=document.getElementsByTagName("script");l=b[b.length-1].previousSibling;a=l.getAttribute('data-cfemail');if(a){s='';r=parseInt(a.substr(0,2),16);for(j=2;a.length-j;j+=2){c=parseInt(a.substr(j,2),16)^r;s+=String.fromCharCode(c);}s=document.... 阅读全帖 |
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x********e
发帖数: 35261 | 19 QuickChange P出来的质粒是有nick的，需要转化后用宿主的酶去repair。RT-PCR逆转
录出来如果有nick，那降解template的时候就不是环状了啊。如果是RT后用了nick
repair的ligase，怎么知道是in vivo的环状而不是实验造成的artifact？ |
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a****n
发帖数: 43 | 21 这个例子也很有意思。
到底该多大程度上跟别人分享数据呢？难道合作者之间也是手快有手慢无？
Qing-Yuan Sun & Heng-Yu Fan:
CRL4 Complex Regulates Mammalian Oocyte Survival and Reprogramming by
Activation of TET Proteins. Science 2013
Yue Xiong:
CRL4VprBP E3 Ligase Promotes Monoubiquitylation and Chromatin Binding of TET
Dioxygenases Molecular Cell 2014
投稿时间差半年，Yue Xiong实验室的那个日本人估计郁闷死了。 |
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a****n
发帖数: 43 | 22 这个例子也很有意思。
到底该多大程度上跟别人分享数据呢？难道合作者之间也是手快有手慢无？
Qing-Yuan Sun & Heng-Yu Fan:
CRL4 Complex Regulates Mammalian Oocyte Survival and Reprogramming by
Activation of TET Proteins. Science 2013
Yue Xiong:
CRL4VprBP E3 Ligase Promotes Monoubiquitylation and Chromatin Binding of TET
Dioxygenases Molecular Cell 2014
投稿时间差半年，Yue Xiong实验室的那个日本人估计郁闷死了。 |
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m****l
发帖数: 16 | 23 今天刚看到Molecular Cell 的 Erratum。 有些看不懂了。
CRL4VprBP E3 Ligase Promotes Monoubiquitylation and Chromatin Binding of TET
Dioxygenases
Molecular Cell, Volume 59, Issue 6, p1043, 17 September 2015
During the final preparation of this manuscript, the authors accidentally
omitted the reference and discussion of the following paper: Yu et al. (2013
). CRL4 Complex Regulates Mammalian Oocyte Survival and Reprogramming by
Activation of TET Proteins. Science 342, 1518–1521. The reference should
have appeared... 阅读全帖 |
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m****l
发帖数: 16 | 24 今天刚看到Molecular Cell 的 Erratum。 有些看不懂了。
CRL4VprBP E3 Ligase Promotes Monoubiquitylation and Chromatin Binding of TET
Dioxygenases
Molecular Cell, Volume 59, Issue 6, p1043, 17 September 2015
During the final preparation of this manuscript, the authors accidentally
omitted the reference and discussion of the following paper: Yu et al. (2013
). CRL4 Complex Regulates Mammalian Oocyte Survival and Reprogramming by
Activation of TET Proteins. Science 342, 1518–1521. The reference should
have appeared... 阅读全帖 |
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D***a
发帖数: 516 | 25 从一篇文章上抄来的：
cDNA encoding 'artificial' SUMO-2 'polymers' was generated by ligating PCR
products encoding DeltaN11–SUMO-2 while simultaneously digesting with
restriction enzymes specific for BamHI (N-terminal site) and BglII (C-
terminal site) in T4 DNA ligase buffer, 150 mM NaCl, 0.1 mg ml- 1 BSA at 22
°C for 5 h (enzymes and buffers from New England Biolabs). This created a
range of cDNAs encoding DeltaN11–SUMO-2 cDNA 'monomers' and 'multimers'
that were separated by agarose gel electrophoresis ... 阅读全帖 |
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b*****s
发帖数: 169 | 26 1.酶切后需要胶纯化再做连接
2.Q5之后要用PcR产物纯化kit纯化后再用Taq加A
3. T载体是pGEMT吧，有蓝色克隆吗？没有的话就是你的载体或是感受态细胞有问题，
或是抗生素用错了。
你的PCR有你想要的条带，一般不会是引物设计的问题了。
另外建议用0.5ul T 载体，10xligase buffer，加ligase，然后加的PcR胶纯化产物至
最终体积，4度过夜
祝好运！ |
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s******y
发帖数: 28562 | 27 要用gene-specific primer. 可以用DNA oligo。 但是这个做法在我的经验里效率不高
（我怀疑那些公司瞎说）。
如果没有gene-specific primer，另外一种方法就是用5'-mRNA head structure 用烟
草病毒的一种酶来切掉之后再用RNA ligase来把一个已知序列的片断连上去，然后从那
个来扩增。 |
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m******5
发帖数: 1383 | 28 5'RACE么（就是胖头鱼说的，RNA-ligase mediated 5'RACE）其中一条引物就是GSP啊 |
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发帖数: 1 | 29 For those who can not access the link
I copied the content here:
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
NgAgo
15 posts by 9 authors
Davide Seruggia
Jun 23
Hi,
I tried a couple of transfections with the NgAgo plasmid from Addgene and
the 5'P oligo against GFP from the paper, but I did not see a dramatic
reduction in GFP+ as seen using Cas9 and a GFP sgRNA.
Anybody tried as well and came to the same (dead) end?
Davide
k*****[email protected]
Jun 24
Hi, Davide,
I tried th... 阅读全帖 |
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F****8
发帖数: 289 | 30 His Hypothesis on how NgAgo function （他的原话）:
Firstly, as many, I have found strictly NO EVIDENCE for genome editing with
NgAgo after multiple attempts. Secondly I found instead a ‘Ligase’ like
activity of NgAgo under normal PCR conditions, which has strictly nothing to
do with the endonuclease activity claimed in Han’s paper. It seems to me
that the NgAgo enzyme needs to be heated over 50 C to function, which is in
direct contradiction to the Han’s paper. |
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m****a
发帖数: 270 | 31 不能同意更多，PCR做得太烂了。。。
把引物扩增非特异产物认为是NgAgo有ligase的功能。。。。
还认为NgAgo 能通过纯化DNA的步骤活下来跑到PCR反应里面，然后还能98度反复变性而
不失活。。。
澳洲国立大学好歹也是著名大学，怎么就让这种傻逼当上PI的呢？ |
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H****N
发帖数: 997 | 32 Dear colleagues,
the publication by Gao et al in May in Nature Biotechnology http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27136078 triggered an enormous expectation. This Chinese team led by Chunyu Huan reported that the Argonaute (Ago) protein from a rare haloarchaea, Natronobacterium gregoryi, (NgAgo) would efficiently work for gene editing purposes in human cells. Ago had been described as an DNA-guided endonucleases two years before, through a Dutch-Spanish microbiologist collaborating team (Swarts ... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 33 【 以下文字转载自 Military 讨论区 】
发信人: hanchunyu (), 信区: Military
标 题: 韩春雨是第二个小保方－业界专家的信
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Jul 29 11:59:57 2016, 美东)
Email on ngAgo sent to the ISTT mailing list：
Dear colleagues,
the publication by Gao et al in May in Nature Biotechnology http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27136078 triggered an enormous expectation. This Chinese team led by Chunyu Huan reported that the Argonaute (Ago) protein from a rare haloarchaea, Natronobacterium gregoryi, (NgAgo) would efficiently work for gen... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 34 国际转基因技术协会原主席Montoliu博士建议不要再试图重复韩春雨实验结果
澳大利亚国立大学Gaetan Burgion今天撰写长文介绍他试图重复河北科大韩
春雨创立的NgAgo基因编辑技术的经过，得出结论：韩春雨的实验无法重复，而
且与韩在论文所说矛盾；《自然·生物技术》应要求韩公布原始数据；该技术显
然没有前途。
国际转基因技术协会创建者和原主席Lluis Montoliu博士根据这一结果以
及其本人实验室的实验结果，向国际转基因技术协会会员发出一封公开信，建议
停止继续试图验证韩春雨的实验，不要再浪费时间、金钱、人员和项目。
CRISPR谷歌群针对这项技术和韩春雨的文章的调查表明，140个调查回复中，
只有一个（中国神经所仇子龙？）回答该技术起作用，73个回答无效，63个回答
在验证。
From: [email protected]/* */ on behalf of Lluis
Montoliu To: ISTT List
Subject: [ISTT_list] Great disappointment with Ago: Long life to
CRISPR... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 35 http://www.webjb.org/rainbowplan/bbs/topic.php?topic=234590
那位Gaetan Burgio更搞笑
虹桥科教论坛 http://www.rainbowplan.org/bbs/edu/
送交者: iamback 于 2016-08-04 10:24:12
回答: 凭常识判断事情最多不了了之，韩想靠此扬名立万是不可能了 由 Dishui324 于
2016-08-04 08:26:27
他自己的PCR结果一团糟，然后就得出推测：NgAgo是一个连接酶！
他的意思，含有NgAgo基因的质粒进入细胞后，被翻译为NgAgo蛋白，然后这个蛋白存在
(污染？)于提纯基因组DNA的产物中，在PCR反应的条件下(55度)，这个污染的NgAgo就
有了活性，把primer连接到DNA上。
而且的而且，如果primer浓度非常高的话，就降解了这个NgAgo，使其失活。
这种想象力也太丰富。
Gaetan Burgio:
----------------------------------------
My Hypothesis on how NgA... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 36 更新后的Note部分：
（NBT 原文里没有）
Note:
1.NgAgo/gDNA system is extremely sensitive to contamination of intracellular
bacteria (including mycoplasma) which are widespread and leave no visible
signs of presence. Carefully excluding the presence of intracellular
bacteria before performing experiments.
编者注：不能有细菌污染
2.Because Agos need magnesium, avoid EDTA when detaching and seeding cells
into the plates for transfection. Alternatively, supplementing Mg2+ to 5 mM
(may need optimization to your cell type).
编者注... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 37 我们学校图书馆没有今年的diabetes文章，请亲们帮忙。第一次发帖，谢谢啦！
我的邮箱[email protected]/* */
Diabetes. 2016 Sep 22. pii: db160506. [Epub ahead of print]
Ubiquitin Ligase COP1 Controls Hepatic Fat Metabolism by Targeting ATGL for
Degradation.
Ghosh M1, Niyogi S1, Bhattacharyya M2, Adak M1, Nayak DK3, Chakrabarti S2,
Chakrabarti P4. |
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w*********1
发帖数: 27 | 38 请问各位老师可以帮忙推荐好用的MDM2（E3 ubiquitin-protein ligase ）抗体 for
WB 吗？试
了几个都不work。Thanks~ |
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w***o
发帖数: 151 | 39 We can add a 5'-PO4-DNA (Single Stranded) to the 3'-end of a ssRNA using T4
RNA ligase I, but cannot add a 5'-PO4-RNA (single Stranded) to 3'-end of
ssDNA.
Highly appreciated any suggestion on how to add a ssRNA to a ssDNA. Thanks a
lot |
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p**h
发帖数: 99 | 41 理论上, 有ligase, 就可以克隆 (in vitro). DNA可以用化学法, 超
声等弄断, DNA polymerase 补起, 连接, 筛选. that is just really hard to do.
but not impossible. |
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g******k
发帖数: 188 | 42
I forgot one thing, it was suppose to be 1950's, when there is either no PCR
nor ligase, |
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p**h
发帖数: 99 | 43
not ligase, syn the DNA. |
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m****g
发帖数: 530 | 44 蛋白质是生物体最重要的组成物质之一。在细胞内，各种蛋白质的产生、折叠主要在内
质网(endoplasmic reticulum ,ER)
上进行。然而在蛋白质的生产过程中，也常常发生错误，蛋白质可能出现错误折叠，在
环境胁迫下，细胞也可能产生并积
累有缺陷的蛋白质。若有缺陷的蛋白质在细胞类累积过多，将可能引起诸如阿兹海默症
、帕金森症等疾病。因此，有缺陷
的蛋白需要被及时的识别并清理。
细胞内存在一个蛋白质质量控制过程，其中HRD泛素连接酶(HRD-ubiquitin ligase)对
缺陷蛋白的识别起关键作用。HRD
泛素连接酶的功能类似于一种标记机器，当它识别出有缺陷的蛋白质后，会在该蛋白上
标记上泛素(ubiquitin)分子,随后该
蛋白将会被降解。但目前为止，科学家还不清楚这种酶复合体如何能够识别和标记各种
类型的蛋白质。
在最近的这项研究中，研究人员发现了HRD泛素连接酶最重要的“脚手架”——Usa1亚
基。Usa1亚基能够将该酶复合体的
各个亚基连接起来，组成一个完整的酶复合体。当识别并标记某些水溶性蛋白质时，
Usa1能够使Der1和Hrd1亚基连接起
来。
研究人员还 |
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