b**********8
发帖数: 349 | 1 如题，lab里面之前一直用的磷酸钙沉淀法，个人觉得特别繁琐。我比较懒，想换用
lipo2000或者genejuice来转，我们一直用的是PLKO.1shRNA+PLP1+PLP2+PLP/VSVG系统
，在10cm dish里面操作。有谁使用这套系统制备慢病毒，并且刚好也用lipo2000或者
genejuice转染试剂的，甩一个你们的成熟的protocol给我吧，特别是各质粒的用量，
换液时间，收集上清的时间等参数，越详细越好啦。不想为了摸索条件再浪费1个礼拜
的时间了。
谢谢 |
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b**********8
发帖数: 349 | 2 这个问题快困扰我一年了，今天特意翻墙过来求助各位大大，
事情是这样的，之前在博士的实验室一直用pLKO.1-puro shRNA干扰基因表达，用的
invitrogen的包装质粒（PLP1，PLP2和VSVG），在10cm的dish里面用HEK293FT转染，转
染用的是磷酸钙沉淀法，病毒上清用SBI的 precipitation solution（5x）浓缩，一直
都work well，偶尔偷懒奢侈一把用lipo2000转染，效率也是没得说。自去年博士毕业
回国后来到现在这个小实验室，当时雄心勃勃自信满满，打算自己包装慢病毒，用的还
是跟之前一样的质粒，细胞，只不过换到了T75的flask里面，用lipo2000转染（磷酸钙
转染法配buffer太烦，实验室pH计不准，老板对经费管的也很松，哈哈），之后用同样
的方法收病毒上清，浓缩。感染细胞后加puromycin筛选，染毒的细胞都能活下来，而
对照细胞48小时候就死光。可是收集细胞蛋白做WB却一点都看不到knockdown，前前后
后重复好几回了，都是一样的结果，现在无奈把这一块交给公司做了，但是自己还是不
死心，今天写出来问问大家... 阅读全帖 |
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w*****g
发帖数: 20 | 3 现在最好转染试剂是哪个？价格要适中
我用lipo2000, 转染的时候要换成没有抗生素的medium.有点烦这一步。 |
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j********r
发帖数: 156 | 4 多谢艳阳天! 是lipo2000吗,还是普通的lipofectamine? |
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f******k
发帖数: 856 | 5 我用lipo2000，转染的时候也都用友抗生素的培养基，我没发现细胞有什么不好，你可
以试试 |
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w********r
发帖数: 1431 | 6 293就不要用磷酸钙转了吧，配起来用起来都麻烦的要命。
有钱的话就用lipo转，想省钱就用PEI。
两三百刀买点PEI，可以配两升，用量用法和lipo2000一样，转293效率高达90%。两升
可以用到地老天荒了。 |
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k******n
发帖数: 39 | 7 I have tried lipofectamine2000, electroporation and lentivirus. Lipo2000 had
the best efficiency in short-term use, and the virus had much better long-
term transfection efficiency. |
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o**4
发帖数: 35028 | 8 我就是用来转染293细胞的，
lipo2000还是太贵了啊，我们用量很大 |
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i*****g
发帖数: 11893 | 9 最便宜的数 PEI，效率还可以，比不上lipo2000之类的，不过管用了 |
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C******r
发帖数: 790 | 10 哪种方法好转染？磷酸钙，PEI，Fugin6, Lipo2000, Lipo-plus？
或者都不容易转染？就只好硬着头皮再一个一个往lenti-vector里装。MEF是否比较容易
被lenti感染？
Thanks for answer. |
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B******o
发帖数: 496 | 11 你要转染啥？siRNA的话Lipo2000 KD效率到80%很容易
质粒的话，还是别试了，非常难转
容易 |
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o**4
发帖数: 35028 | 12 质粒应该没问题吧，一直用的是这个。
我用的PEI做的转染，下次用lipo2000试试 |
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l******i
发帖数: 17 | 13 Look in Invitrogen Lipo2000, there is recommended number for cells needed.
Roughly it equals to the area of 24-well plate. |
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s******a
发帖数: 472 | 14 实在不好意思，又把这个帖子顶起来。
从国内回来一个月了，一直在转我的BAC DNA，一直在失败。
我想总结一下失败的经验，并且继续求教大家：
我需要转染的细胞是Hepa 1-6，小鼠肝癌细胞，8-well plate 每孔种10000个细胞 ，
第二天转染。固定lipofectamine用量（量大毒性大），优化的主要是DNA和
lipofectamine的比例。每孔转10 ng 到数 ug之间的range都试过，没有能够work的。
用普通质粒作为阳性对照，转染效率相当高，80-90%是有的。
这篇nature method文章用lipofectamine转BAC到小鼠ES细胞，10 cm2 的碟用10 ul
lipo转150-350 ng BAC DNA（protocol在supplementary，但是有typo，写的是150-350
ug）。我和文章作者email也联系过，他们转染的效率也只有1-2%。
所以现在唯一能确定的是转BAC DNA（我的约250kb）还是比普通质粒要难很多的。目前
对于lipo2000也已经没有idea了。
我现在开始尝试电转，第一次参数不合适细胞全死... 阅读全帖 |
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s******a
发帖数: 472 | 15 实在不好意思，又把这个帖子顶起来。
从国内回来一个月了，一直在转我的BAC DNA，一直在失败。
我想总结一下失败的经验，并且继续求教大家：
我需要转染的细胞是Hepa 1-6，小鼠肝癌细胞，8-well plate 每孔种10000个细胞 ，
第二天转染。固定lipofectamine用量（量大毒性大），优化的主要是DNA和
lipofectamine的比例。每孔转10 ng 到数 ug之间的range都试过，没有能够work的。
用普通质粒作为阳性对照，转染效率相当高，80-90%是有的。
这篇nature method文章用lipofectamine转BAC到小鼠ES细胞，10 cm2 的碟用10 ul
lipo转150-350 ng BAC DNA（protocol在supplementary，但是有typo，写的是150-350
ug）。我和文章作者email也联系过，他们转染的效率也只有1-2%。
所以现在唯一能确定的是转BAC DNA（我的约250kb）还是比普通质粒要难很多的。目前
对于lipo2000也已经没有idea了。
我现在开始尝试电转，第一次参数不合适细胞全死... 阅读全帖 |
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w***a
发帖数: 1053 | 16 病毒
电转
lipo2000+无血清optimedia+质粒overnight,但是这样细胞死的也多 |
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b****s
发帖数: 148 | 17 40pmol RNAi vs. 1ug dsDNA worked fine for me.
i used lipo2000 |
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w********r
发帖数: 1431 | 18 分别转，lipo2000转质粒的效率在我的手里效率比较差（也可能我们的细胞比较不容转
染）。
siRNA和lipoRNAiMax在一个管子里混好，
DNA和lipofectimine或者lipoLTX在另一个管子里混好，
然后一起加进去。
因为两种东西一起加毒性会大一点，细胞会死一些，
所以转染的时候，细胞的起始密度可以比单独转染siRNA或者质粒的密度要高一点 |
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s****u
发帖数: 483 | 19 14k should be no problem for transfection using lipo2000. no expression?
promoter promotor promotor... |
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X******n
发帖数: 914 | 20 多浪费，快去sigma买一瓶Pei,配上1升够你实验室用几十年了。效率不比lipo2000差。 |
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r******k
发帖数: 446 | 21 如果按着lipo2000说明书上写的 在90%左右 cell confluence的时候做transfection，
那第二天细胞就长的满满的了，这能行吗？ 是不是有contact inhibition？等细胞长
的很满了， 我可否trypsinize 然后转到更大的dish里面养？ |
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j****t
发帖数: 1663 | 22 我一般是70-80%confluence的时候做transfection，这个也要看什么样的细胞，有些细
胞分裂速度慢，多铺一些细胞应该也没有关系。
如果你已经用lipo2000做了transfection，我觉得第二天就trypsinize不太好。
建议你下次转一个带荧光的质粒，看看转染效率，这样你就知道铺多少细胞最好了。 |
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