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p*****m
发帖数: 7030 | 2 恩纳 你这个说的蛮有意思 啥时候有了toxicity marker的idea出来八八
我觉得这个主要还是delivery的进步，不管是用病毒的壳还是用NP+某targeting prote
in。这些肯定是会很有作用的（对了 我看过些用HBV做的壳用来delivery的文章 似乎实
际用起来效果没那么好？） 但是按说这个target specificity没有完全解决PKPD的问题
，比如说吧 这样也阻止不了most if not all的NP进到肝细胞里面，然后被无穷无尽的
P450和其他酶搞成碎片或者变个模样；
同样的，如果要是简单的杀死细胞，NP里面弄个toxin也还好，但是大部分的病除了can
cer以外你未必想要杀死那么多细胞（还是你这个肝细胞的例子 其实HBV里面致病的不是
HBV倒是肝细胞死掉，你要是也一杀了之那就等于催化肝病了），二是要定点清除细胞里
的感染性物质（对感染性疾病而言） 或者改变细胞内某个蛋白的活性等等（对代谢性疾
病而言），这样你还要保证你用的小分子在实施作用之前不会在lysosome或者golgi ap
peratus里面被加几个修饰集团 等等，或者干 |
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p******h
发帖数: 68 | 3 不太熟悉LAMP1&2在蛋白水平提高意味着什么，是lysosome数量增加？还是lysosone功
能增强了，or。。。。。。。。。。。。。。 |
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j**********k
发帖数: 296 | 4 按说data quality差些无所谓，但这篇真算是极品了。editor该被fire掉，天雷滚滚的谬误竟然也可以送出去给reviewers？reviewers也是吃屎了，即使print out都该能看出一堆问题。
RETRACTED: VMA21 Deficiency Causes an Autophagic Myopathy by Compromising V-
ATPase Activity and Lysosomal Acidification
Reason: Our paper reported the identification of mutations in the
gene VMA21 in patients with X-linked Myopathy with Excessive Autophagy (XMEA
) and characterized the molecular mechanisms underlying the disease
phenotype. Many of the figure panels in the paper summ |
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b*********2
发帖数: 35 | 5 大概的说，有出处吗？
如果是转染一天后的，或者两天后的？
那个时间点应该多些呢？ 为什么呢？
谢谢。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 6 有大量的蛋白在合成之后是会被切的。如果是信号肽，有一些算法可以预测。
如果是calpain 切的话也勉强可以预测，
如果是被ER, golgi, lysosome那些乱七八糟的蛋白酶切的话就更难预测了（主要是数
据库没有建立起来） |
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q*******8
发帖数: 768 | 9 这个。。。直接和实验室老板联系比较方便吧。。。不然拿到了都来路不明。。。 |
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S*****s
发帖数: 287 | 10 我想搞清楚一个在细胞质内的突变蛋白是怎么被降解的。这个蛋白的野生型有两种
alternative intron splicing 的 product，姑且叫 wildtype 和 wildtype2 吧。我
在 293 细胞内表达两个 wildtype 和 mutant 蛋白，然后用 proteosome inhibitor
（Lactacystin) 和 lysosome inhibitor （Chloroquine, Leupeptin) 来处理细胞。
实验结果发现 Lactacystin 处理之后 wildtype 蛋白含量不变，wildtype2 含量升高
，但是 mutant 蛋白含量下降了。Chloroquine 和 Leupeptin 处理之后也不见 mutant
蛋白含量升高。Excel 的分析图也随帖附上。这样我就搞不明白这个蛋白是被什么降
解的了。请问版上的各位大牛能不能指点一下，下一步应该从什么角度去研究蛋白降解
？先谢谢大家了！ |
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p*****m
发帖数: 7030 | 11 我觉得这么说吧：现实中大概超过95%的lead compound在preclinical和phase I被kill
掉吧（我记不住了 也许更多）。主要原因一是药代有问题，比如说到不了该去的organ
,或者进了细胞被golgi修饰了被lysosome讲解了,blabla；第二个是safety，直接把动物
搞死了再有用也不行。这两点在cell based screen里都解决不了。
如果用fish替代cell based screen的话，这两方面都会有进步。药代肯定要好得多，至
少细胞内修饰问题应该是保守的；safety方面，这个要看做出来的结果fish和mammal有
多大相关性了。今年fish meeting我看到有两个pharma再尝试validate fish as a tox
icity model，其中一个是pfizer还有一个忘了，还没有什么结果倒是，但是如果相关性
不错的话这方面fish也有优势。 |
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b********i
发帖数: 73 | 14 Bafilomycin A1, chloroquine or NH4Cl |
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S*****s
发帖数: 287 | 17 Lysotracker 不错，不过只适合做 live cell imaging。用 PFA fix 之后就没信号了
。如果一定要做 fixed cells 的话还是用抗体吧。 |
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j****g
发帖数: 406 | 18 我用Invitrogen的Lysotracker从来都是fix后再看的，好像没有大问题啊。
倒是mitotracker fix后在显微镜下bleach非常快。 |
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m***6
发帖数: 424 | 19 谢谢各位兄弟姐妹，我试过了lysotracker不行所以才问的，live cell，1000uM都不行
，哎，麻烦死了，LAMP老板不让试，说人家都是lysotracker染的你怎么染不上？ |
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P*******D
发帖数: 523 | 20 你用的lysotracker啥颜色的dye？一般红色的比绿色的好用，bleach的慢。1000 uM太
高了。 |
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S*****s
发帖数: 287 | 21 不好意思一直没登陆 MIT。我以前试过 Lysotracker。按照 Invitrogen 的 Manual 做
的染色，不过我染色之后试了一下Paraformaldehyde 固定。没有加 PFA 的细胞能看
到类似于网上图片的染色 pattern，加了 PFA 的细胞就没信号了。1000uM 看起来浓度
有点高。我刚查了一下 Invitrogen 的 Manual，推荐的浓度是 50-70nM。你是不是重
新 dilute 一下原液？ |
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m***6
发帖数: 424 | 22 嘿嘿，谢谢你啊
confocal老师也说是固定的时候bleach out的
呵呵，不过不固定怎么看啊？活细胞看吗？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 24 我觉得是。
除非是膜蛋白被回收降解的时候，没有降解完全的细胞外片断不小心又通过
lysosome 的膜跑进细胞液内部了。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 25 蛋白降解一般而言可以至少有两个途径：proteasome, lysosome, 再加上limited
proteolysis by calpain or other proteases.
前者可以用MG132 or beta-lactone
中间可以用100mM NH4Cl
后者可以用calpain inhibitors
MG132 本身是一个小多肽模拟物，一般认为是堵塞chymotrypsin-like cleavage
activity. 所以其实也不是一个很干净的inhibitor, cross-react with calpain and
other protease. 但是它在浓度比较高的时候(20uM) 对proteasome 抑制
是非常明显的。
beta-lactone 主要通过和proteasome subunit crosslinking 而起作用，比
MG132 专一性稍微好一点点，但是抑制作用不是特别明显。
不管哪个inhibitor 都不能完全解决问题。我不能说你的导师到底是对还是错，
但是你应该找其他方法来佐证。比方说，你可以看看蛋白用这个东西处理的时候，
... 阅读全帖 |
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n***w
发帖数: 2405 | 27 如果不加抑制剂，LC3II增加说明两个问题：
1、autophagosomes增加
2. LC3II degradation减少 （需要lysosome）
如果加了氯奎，LC3II增加，则排除了2。 |
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n***w
发帖数: 2405 | 28
我觉得解释lc3ii增加的wb还是比较tricky的。
既然lysosome被抑止了，lc3ii 增加，我觉得是说明autophagosomes增加，即
autophagic flux 增加。 |
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n*******l
发帖数: 75 | 29 各位大侠们，我在做用6ohda处理细胞的时候，发现一个蛋白的水平降低，文献表明可
能是proteasome（实验是过表达此蛋白，然后用MG132处理，发现蛋白增多；）或者
caspase降解（在细胞中过表达此蛋白和各种caspase酶,发现蛋白降解）。
我于是用proteasome inhibitor MG132与6OHDA 同时处理，并没有发现此蛋白水平回复
（保证MG132其作用，有阳性对照蛋白）。换用caspase inhibitor和6OHDA处理，也没
有发现次蛋白水平回复，换用lysosome inhibitor和6ohda同时处理，也没有发现次蛋
白水平恢复。
请教别人，说proteasome的inhibitor MG132 并不足以阻止proteasome。说一些好的杂
志都不接受MG132作为proteasome的inhibitor。是这样么、？那有什么好的推荐么？
另外一种可能行是我用药物处理之后，蛋白水平下调，是因为我的蛋白沉淀了，在我的
buffer里面是没有的。但是我是用cell signling公司的buffer20mM Tris， 150mM 氯
化钠，1... 阅读全帖 |
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q******g
发帖数: 3858 | 30 他不做transporter, 他更关心leucine是如何激活mTOR的。虽然发现Rag和lysosome 的
作用，但中间还是少了个环节。以前的实验证明不是transporter激活下游的通路，但
也有可能错了呢？ |
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q******g
发帖数: 3858 | 31 他不做transporter, 他更关心leucine是如何激活mTOR的。虽然发现Rag和lysosome 的
作用，但中间还是少了个环节。以前的实验证明不是transporter激活下游的通路，但
也有可能错了呢？ |
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r**a
发帖数: 121 | 33 看了这个文章，这样一来，似乎leucine就没有特殊了
而且，aa ester也有同样的作用了
而且，tor是不是变成了lysosome 的aa sensor了
或者说，只要改变了vATPase的结构，就影响了tor了
继续看他们倒底在做什么啦，呵呵 |
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w***a
发帖数: 4361 | 34 lysosome associated membrane protein one
LAMP-1 这个好像是个late stage marker
早期的有rab5什么的。 |
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a*****n
发帖数: 2835 | 35 看看是不是endosome/lysosome
染EEA1或者LAMP试试
转到别的细胞有同样的现象吗？ |
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j******1
发帖数: 1315 | 36 刚刚接触这个没经验，大家别笑话。我的理解是Chloroquine促进形成AV，但是AV不能
被Lysosome降解，所有既是促进autophagy 又抑制。我的理解对吗？ |
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v*********d
发帖数: 382 | 37 Chloroquine 阻断autophagosome 和lysosome fusion, 导致autophagosome
maturation 受阻，并且accumulate
不能因为autophagosome 多就说是促进了autophagy. 这个是刚开始的时候的一个误解
，所以现在western 的话，LC3 和 p62都要 |
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V***b
发帖数: 3419 | 38 现在要比较一下在两个细胞里的proteasome活性，这两个细胞太不一样了，proteasome
, lysosome，autophagy的水平都不一样。所以要单纯比较proteasome活性的差异不能
看global protein turn-over。我想到的是观察完全依赖proteasome降解的蛋白，谁能
介绍几个，谢谢。或者有其他的什么手段更好的测定proteasome活性？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 39 用来测proteaasome activity 的 ub-GFP必须是那种不能被cleave 的ub，
否则表达过程中就被抢先cleaved 了。
所以这个de-ub 不是一个问题。
成问题的主要原因是因为ubiquitinylated protein 也能成为lysosome,
autophagosome的底物，所以不是那么的特异。
如果这个问题对你们非常重要的话，我建议你用三种方法来重复：
1. uncleavable ub-GFP
2. P53 or H1f, by using cycloheximide or pulse trace
3. partially purified proteasome with artificial substrate
然后再加上一个加beta-lactone 的逆对照
autophagy |
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a*****x
发帖数: 901 | 40 ER stress 引起autophagy，形成lysosome的vacule。这是最常见的原因。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 41 sunny day
是专利的话 有基金可以负担没?
pls refer:
Spacer: As used herein, the term "spacer" (also referred to as "linker")
refers to a peptide sequence between two protein moieties in a fusion
protein. A spacer is generally designed to be flexible or to interpose a
structure, such as an alpha-helix, between the two protein moieties. A
spacer can be relatively short, such as the sequence Gly-Ala-Pro (SEQ ID NO:
4) or Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro (SEQ ID NO: 5), or can be longer, such as,
for example, 10-25 amino a... 阅读全帖 |
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s******a
发帖数: 472 | 43 Nice...
A forward genetic screen... |
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p********r
发帖数: 147 | 44 NIBS的成功：说明在中国有科研基金，不受外界干扰，还是能做好科研的。但是现在很
多人只是做官，不做学问！ |
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b******y
发帖数: 627 | 45 Nod. But new returns should be more lean to science than politics. good
trend, keep it up. |
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F*Q
发帖数: 3259 | 46 希望不要把美国的体制照搬。学生和博士后还是需要由单位来管理而不是完全由老板掌
握。 |
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h****k
发帖数: 182 | 47 google也没查到什么权威的解释，有人知道吗？ |
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h****k
发帖数: 182 | 48 really clear now. thank you! |
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l**********1
发帖数: 5204 | 49 楼主 你能发现特例 就是 既可以 endo 一移动又可以lyso or phago 的话
draft 上CNS 吧 |
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h******y
发帖数: 351 | 50 我想看培养细胞中有多少senescence，大家觉得这些marker（SA-b-Gal，r-H2A.X，
Ki67-negative，Heterochromatic foci）中，哪个最好（准确率高，方便）？
有人有用flow cytometer对senescence细胞定量的经验吗？我想用C12FDG，但是感觉把
活细胞的lysosome中的pH调到SA-b-Gal需要的6左右很难。文献中用300uM chloroquine
处理细胞2h，再加33uM C12FDG，4小时或过夜后检测荧光信号。有人用过这种方法吗？
能否分享一下经验?
多谢 |
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