h******y
发帖数: 351 | 1 In your case, I think you might want to try different protocol. A good
protocol should yield nice MEF culture from the wildtype embryo at least.
The most important thing is to avoid overdigestion with trypsin, which will
always leads to poor culture.
[发表自未名空间手机版 - m.mitbbs.com] |
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s******y
发帖数: 28562 | 2 对了，你有没有最新的比较温和而成功率又比较高的immortalization MEF的方法？
我们合作者那里有一个新的cell line, 他们用3T3 protocol 试图了好几次都没有
成功。现在我实在是等不及了，打算自己来诱导，但是既然他们没有成功，可能
我们也不一定能成功。
findings |
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l****j
发帖数: 70 | 3 我见过有人就用的wt MEF 然后转染shRNA做成KO,但是只有80%左右ko了。
findings |
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m*****z
发帖数: 1451 | 5 取embryo，去头和内脏，剪碎，0.25% trypsin 37oC消化10分钟，seed在10cm盘，3-4
天传代
一直这么做没问题，不过从来没有handle过比较神奇的MEF就是了。 |
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h******y
发帖数: 351 | 6 你这消化的时间太长了。
我的方法给你参考。
E13.5或E14.5，去头去内脏，转到一个预先装有0.25%Trypsin-0.53mM EDTA的3mL注射
器里，从20G的针头中挤过。如果组织块太大的话，多挤几次。然后在37C消化5分钟。
用FBS终止酶消化，离心收集组织和细胞，用5mL pipette重悬。每1-2个胚胎可以铺一
个10cm的dish。一两天后就长满了，这算P0。需要注意的是所有和组织接触的塑料器皿
用前需要先润湿，否则组织很容易粘到上面。
传代用0.25%Trypsin-0.53mMEDTA，37C，3-5分钟。这算P1。从这里起，seeding
density在4-5 X 10^3/cm2. 3-4天或者接近长满的时候分一次。一般在第2或3次的时候
冻足够多的细胞，1x10^6/vial. 运气好的话，一只孕鼠的6-8个胚胎分出来的MEF足够
你用的了。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 7 好的。谢谢！
我先去查查文献。如果还是不明白再来问你吧：）
MEFs |
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y***y
发帖数: 709 | 8 搭车问个问题：
您用低氧培养的时候，MEF的生长速度和普通的CO2培养箱有很大差别？
我一般都是细胞长满了在1：5传代，在7-8代以前，感觉普通培养箱的细胞比低氧的长
快2倍不止。
可过了10代以后，普通培养箱的就慢下来了，低氧的好像却长得快起来。
before |
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h******y
发帖数: 351 | 10 MEF would grow faster in 3% O2 than in 20% O2. Maybe you can try different
seeding and subculture schedule? |
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f*******e
发帖数: 354 | 11 我用mef做脂肪分化，KOMEF长的快，分化的好，然而3t3,3t3l1,C3H10T1/2都是RNAi长
的比ctrl慢，rnai剩余30%，也做不出分化差异，本想做做机制。请牛人帮忙解释下，
怎么个情况？
谢谢大家 |
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m******f
发帖数: 25 | 12 我用的是很多文章常用的诱导方法：原代MEF(passage<5), 长满后2天开始诱导(1uM
dexamethasone, 0.5mM Isobutylmethylxanthine (IBMX), 5ug/ml insulin.)2（或4）
天， 然后换成含insulin培养基培养6天左右，2天换次液。
可是分化效率很低，adipocyte的比例只有20%左右，一般很多文章都达到80%。
请各位帮忙诊断一下，谢谢 |
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r******k
发帖数: 446 | 13 大神们解答一下？ 每次都seed MEF太崩溃了~ |
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m******5
发帖数: 1383 | 14 看细胞系，看用来干嘛，如果要求germline transmission那是必须铺
铺MEF都崩溃也太夸张了
mES 怎么着也是全球排名前10好养的细胞系 |
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J********3
发帖数: 3151 | 15 我用的pCAG2LMKOSimO，MEF确实转染效率很低，但选的是stable lines，也无所谓了，
大不了多用点细胞，俺用0.6mg/ml的G418筛十几天，挑的客轮，效果还可以。MEF是俺
自己做的，immortalized MEF比primary MEF要容易些（俺用p3开始转染成功，p2应该
没问题），但个人感觉immortalized MEF诱导的iPS没多大用，因为在漫长的
immortalize过程中发生了n多的事情，细胞基因组本身已不大稳定，iPS估计很容易癌
变。
( |
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j*****d
发帖数: 787 | 16 I am curious if we can do the following short-cut transformations:
Mouse Embryonic Fiberblast (MEF) ===>>> mouse embryonic neural stem cells
Mouse Embryonic Fiberblast (MEF) ===>>> mouse cancer-like cells (without
extra expression of oncogenes)
each of two needs to start with MEF.
anybody can help (and link) ? |
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J********3
发帖数: 3151 | 17 我们也是从addgene买的，因为没认真做这个，就是大概齐建立个方法以备将来用，还
真没观测过荧光，不过293T跟MEF表达水平差太远，肉眼几乎看不见荧光也正常，俺以
前用U2OS做GFP-tag的稳定细胞株，初期能看见很绿，到挑克隆时也基本看不清了，但
用FACS能sort。俺的primary MEF是3/48的iPS，比永生MEF少几倍，俺们lab另一个人是
0/96，俺也不大清楚他为啥就不灵。
实在不行，可以把培养基里加点GSK-3 inhibitor，俺加了2i，90%以上的胚ICM能诱导
出ES来，不加的话，也就30-50%的胚ICM能诱导出ES来，这个不是简单的两三倍差别，
应该是非常大的差别。
293T |
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m******5
发帖数: 1383 | 18 常规做法是MEF+LIF
MEF不光起到分泌LIF的作用还起到一个生长matrix的作用
养过MEF培 |
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h******y
发帖数: 351 | 19 裴端卿这个利用维生素C的想法其实很巧妙。大家都知道体外培养的MEF对ROS很敏感，维
生素C是ROS的Scavenger，很早就被用来延长MEF的培养。裴端卿的办法把MEF的reprogr
amming效率提高了几十倍。
可惜人的fibroblast对ROS的抵抗力很高，所以维生素C不能提高人的fibroblast的repr
ogramming效率。 |
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l*******i
发帖数: 153 | 20 VC可以提高MEF的reprogramming的效率，不是因为其抗氧化性，而是其histone
modification的能力，因为1）VC处理的MEF与未处理的MEF相比，其ROS水平并没下降；
2）其他的ROS scavenger并不能提高reprogramming的效率。
人的ESC和小鼠的有本质的不同，这可能是VC对人的fibroblast reprogramming没有效
果的原因。
，维
reprogr
repr |
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m******h
发帖数: 38 | 21 最近做一个基因，杂合子已经能看到点表型，纯合子胚胎致死，根本拿不到MEFs。
现在考虑 直接把conditional KO MEFs 直接用Ad-Cre感染来拿细胞。但是后续要做成
瘤实验，需要immortalize MEFs. 时间紧，请问在美国目前有什么公司可以提供
transform cell的服务？
谢谢大家。 |
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q**********0
发帖数: 335 | 22 请问MEF是Master of Financial Engineering 吧? MEF有奖学金吗? 国内IEOR专业能申
请MEF吗? 谢谢! |
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s**d
发帖数: 18498 | 23 美国海军陆战队可以分为三部分，舰队陆战队，海军警卫部队，其他警卫部队。舰队陆
战队是海军陆战队的精华，主要任务设计为两栖登陆，也作为轻型合成部队担负其他任
务。海军警卫部队主要作为海军基地和舰艇的警卫，兼海军需要的很小规模的需要上岸
，上对方船只的任务。其他警卫部队主要就是美国驻外使领馆等单位的警卫。
陆军分为装甲师，机械化步兵师，轻步兵师，山地师，空降师（用大型运输机运输，人
员都是伞兵），空中突击师（用直升机运输）。
舰队陆战队的编制非常灵活，采用的是和海军类似的行政与指挥完全分开的系统。指挥
分为3级，最高级是Marine Expeditionary Force，一共3个，两个在太平洋，一个在大
西洋，平时部署在美国本土。MEF是达到美国联合作战标准的指挥机构，不仅能够指挥
海军陆战队，也能独立负责一个战役，指挥海陆空三军。当一个MEF战区部署时通常拥
有海军陆战队下辖的各兵种，包括固定翼飞机，直升机和坦克在内。第二级是Marine
Expeditionary Brigade，核心包括陆战部队，支援部队（后勤）和航空指挥部，是陆
战队独立作战的大型指挥机构，一共有4个。第三级是M |
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发帖数: 1 | 24 美国海军能力再升级：航母打击群与“闪电航母”打击群合二为一
近日，美国海军“罗斯福”号（CVN-71）航母打击群与“美国”号（LHA-6）两栖打击
群合并，组成远征打击部队（ESF），在西太平洋、菲律宾海一带举行了为期一周的综
合作战能力演习。
本次的亮点并非“罗斯福”号（CVN-71），而是“美国”号（LHA-6）两栖攻击舰，这
是它替换“黄蜂”号（LHD-1）进驻日本佐世保基地之后进行的首次大型演习，标志着
美国海军航母与两栖攻击舰平台的协同作战能力又上了一个新的台阶。
航母打击群CSG+两栖打击群ESG=远征打击部队ESF
第9航母打击群（CSG-9）司令斯图尔特·贝克尔准将说：“航母打击群的战斗力令人生
畏，再与两栖打击群这类远征作战力量相结合，战斗力将无与伦比。两个团队的合并演
习将进一步提高互操作能力，我们非凡的机动和火力投送能力可以在目标海域快速建立
起压倒性的控制力。”
第7远征打击群（ESG-7）司令雷德·卡彻准将说：“我们两个团队合二为一，不是简单
的1+1，而是获得了更全面的作战能力。‘罗斯福’号卓越的空中力量和我们灵活的、
已具备第五代作战能力的远征打击部队相结... 阅读全帖 |
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M*****n
发帖数: 16729 | 25 帮朋友问的，
因为data太多，必须削减一些，那么哪些可以去掉呢？
（1）knockout mice已经做出来了，是不是那targeting strategy就不需要show? 有
southern blot和western blot就足够了？
（2）有很多quatinfication data,是不是可以省掉graph, 就用文字表述？
（3）有些试验在KO MEF和siRNA knockdown cell lines都做了，是不是可以只show一
些MEF data,提一下knockdown confirm同样结果？
（4）reviewer提出某个sub-aim 缺少prelim data,目前作了一些，是把这个sub-aim全
去掉好呢，还是把data放上，justify这个sub-aim是可行的？
（5）reviewer提出过于ambitious, 怎么address这个问题？是不是应该减掉一些sub-
aim?比如上面（4）这种情况？
(6) reviewer说推荐信写得太好，没有指出candidate的缺点weakness, 这个怎么弄？难道让referee非要说几个缺点出... 阅读全帖 |
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j********r
发帖数: 156 | 26 Please recommend a lipid for primary MEF transfection. Thanks,
Seems electroporation (amexa) gives the rate around 15%, who might be quite
low. There are many lipo products on the market, just name a few
lipofetamine 2000 (with plus)
Fugene 6
GenePorter
GeneCarrier
DreamFect
Superfect
....
which or what else is best for MEF? |
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j********r
发帖数: 156 | 27 Admiring yi xia! It seems that your efficiency is much higher than the two
NS papers using non-viral vector. Just curious which MEF did you use (to
enable transfection and drug selection)? I also tried plasmid transfection (
via lipids) in primary MEF (at passage 2), however, the transfection is
extremely low. Thanks for the great information! |
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j********r
发帖数: 156 | 28 多谢帮助！巧的是我最初从addgene买的两个质粒其中一个就是pCAG2LMKOSimO。在293T
中满眼的红色，在primary MEF中啥荧光都没有。请问你G418拿到的克隆显微镜下有荧
光吗？原来primary MEF也能长十几天，我也来试试。Thanks a lot, |
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D*****l
发帖数: 554 | 29 谢谢您的建议！由于没有玩过knockdown,我想做下面的实验：
分离MEF (Flox/Flox) + adeno virus expressing Cre (or control). 来检测p53表达
量，
再看看 细胞衰老的变化。MEF只能长4--5代，或许我的宝贝基因干掉之后，细胞长的更
快，寿命更长。
test |
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a******n
发帖数: 392 | 30 你是用MEF培养ES细胞的吗？会不会MEF提供了你的细胞的需要的某种蛋白呢？ |
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z*t
发帖数: 863 | 31 有人用一种细胞叫chew LIF(不知道对不对)，会分泌LIF进入培养基。甚至你可以用养过MEF培
养基，或
者用mef。之前我们实验室也是买LIF但实在太费钱了。。。 |
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t***i
发帖数: 114 | 32 对，有的feeder cell （transformed MEF with stably expressed LIF）就可以分泌
LIF。
养过MEF培 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 33 Here you go
Deramaudt TB et al. (2011)
FAK phosphorylation at Tyr-925 regulates cross-talk between focal adhesion
turnover and cell protrusion.
Mol Biol Cell. 22: 964-75.
Abstract
Cell migration is a highly complex process that requires the coordinated
formation of membrane protrusion and focal adhesions (FAs). Focal adhesion
kinase (FAK), a major signaling component of FAs, is involved in the
disassembly process of FAs through phosphorylation and dephosphorylation of
its tyrosine residues, but ... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 34 我惭愧的问一下，这个Pei 对于其他细胞，比方说MEF好用么？我们其实主要是转MEF更
多一些，用来做细胞生物。但是做生化的时候也用HeLa, 293. |
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z*t
发帖数: 863 | 35 important tip in cell selection
Primary cells should be used. We have found that it is difficult to
reprogram mouse embryonic fibroblasts (MEF) that have been expanded in vitro
, while fresh MEF are competent.
Cells from mice older than one week showed very poor reprogramming
efficiency under the current protocol.
hmmm...... |
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z*t
发帖数: 863 | 36 important tip in cell selection
Primary cells should be used. We have found that it is difficult to
reprogram mouse embryonic fibroblasts (MEF) that have been expanded in vitro
, while fresh MEF are competent.
Cells from mice older than one week showed very poor reprogramming
efficiency under the current protocol.
hmmm...... |
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c***l
发帖数: 2490 | 37 一直一来，缺芯少魂一直是中国信息产业的心病，中国的CPU市场也一直被Intel、ARM
等国外厂商垄断，龙芯、申威、飞腾等国产CPU在社会上也往往遭到别有用心之徒诸如
“打磨芯片”、“骗经费”、“政绩工程”等舆论抨击。不久前，采用申威26010的神
威太湖之光在TOP500刷榜，飞腾也公布了采用ARM指令集的飞腾1500A和飞腾2000，龙芯
的3A3000也顺利完成流片，那么这些国产CPU的性能到底如何呢？
如何评价CPU
如何评价CPU的性能呢？从体系结构的角度来看，有个指标叫MIPS，即每分钟执行多少
条指令，执行指令数量越多，性能就越好，但这存在一个问题，当CPU指令集不同的时
候，比较MIPS就意义不大了——比如A一条指令只算一个加法，B一条指令能做一个1024
点的FFT。特别是在不同指令集的情况下，如何评价CPU的性能呢？
评价CPU性能必须考虑应用的多样性，比如科学运算重视双精浮点性能，但是如果数据
供不上，运算能力再强也没用；比如PC日常使用更偏重于定点性能；再比如计算中心多
任务环境关注的是吞吐率......因此单纯用某一个指标来衡量CPU性能是不科学的，必
须综合... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 38 意大利南北年均收入大比拼：穷的穷死，富的富死
发布时间： 2018-06-07 11:03:02 来源：意烩（欧洲时报意大利版微信公众号）
作者：因因 编译 浏览次数：50 评论：0
【欧洲时报特约记者因因编译报道】去过意大利的朋友大都会明显感觉到，以罗马为界
，意大利南北两地之间存在着诸多差异。而在经济方面，南北方更是呈现出两极分化的
态势：从意大利Adnkronos通讯社为意大利经济和财政部（MEF）提供的数据来看，居于
首位的伦巴地大区相较于垫底的卡拉布里亚大区，其人均年收入要高出65.5%，即9800
欧元。
新总理月收入仅6700欧元，被意媒评为“最穷总理”。（图片来源：新华社资料图）
意大利南北收入差距明显
意大利今日网消息指出，如今的意大利依然是一个两极分化严重的国家，南北两方在各
个方面差异非常明显，尤其是在经济方面。
意大利经济和财政部数据显示，2016年意大利的人均年收入为20940欧。其中，西北部4
个大区（利古里亚大区、伦巴地大区、皮埃蒙特大区和瓦莱达奥斯塔大区）的人均年收
入为23860欧，南部6个大区（阿布鲁佐大区、巴西利卡大区、卡拉... 阅读全帖 |
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i***g
发帖数: 551 | 43 应该动员新疆的疆独们出国支援，礼送出境，送些武器。 |
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h****l
发帖数: 7290 | 44 还要考虑人家的快速反应与部署能力，要是用军队去，多少师都没用。
人家增兵的速度比中国快得多。
要完全消灭它们，最好的办法就是把所有战略核弹都扔阿富汗去，
这样他们来不及反应，而且导弹防御系统在那里也不太管用。 |
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B*D
发帖数: 5016 | 45 这个是大特务设想的5-7年后的情况
俄国人需要进行"几周到数月“长度的动员去获得入侵FRG的攻势作业.俄国人在1956年入
侵Hungary,1968年入侵Czechoslovakia,1979年入侵Afghanistan和1980年入侵Poland的
行动前进行持续数周的动员.一般认为,如果假设NATO在俄国动员7天之内因为俄国的欺敌
作业没有侦测到俄国的动员,俄国将在14天的动员中获得对NATO最大的兵力优势.NATO在
一个月的动员时间内可以基本接近俄国的兵力.如果动员长达2-3个月,兵力的对比由俄国
的预备队和双方的工业能力的发挥决定.
关于你的启动条件B:我不知道在这样的情况下,台湾和美国可以获得多长时间的预警.原
因是我不知道他们侦测和识别中国欺敌作业的能力,我也不知道中国,台湾和美国的决策
层和执行层有多少漏洞.
关于你的1-4个判断.1:取决于启动条件B给予台湾和美国的预警时间.2-4:你需要等到PL
A已经以12hr为间隔向台湾运送足够多波次的登陆部队.台湾强化单兵ATM,长程MLRS和武
装直升机是为了平衡2.同时你希望确保B-1B和B-2没有以JDAMs攻击滩头和... 阅读全帖 |
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l****z
发帖数: 29846 | 46 作者:曹长青
2013-08-15 05:10:34
埃及发生第二次革命，军方支持示威民众，把民选总统穆尔西赶下了台。按宪政原则，
这种做法当然违背民主程序，因为穆尔西是通过选票上台的。但为什么西方主要国家，
包括美、英、法、德等，都不强烈要求恢复穆尔西的权力，反而表示保持“中立”呢？
最根本的原因是，整个西方都无法承受埃及变成伊斯兰国家，成为伊朗第二。所以在“
军人干政”和“政教合一”之间，做出“两害相权取其轻”的选择。而且干政的埃及军
方没有谋求自己掌权，而是提出全国大选时间表，仍走民主之路，推翻穆尔西的目的，
只是阻止埃及被伊斯兰化。
为什么西方这么担心、恐惧埃及变成伊斯兰国家？因为如果埃及成为伊朗第二，不仅中
东地区，整个世界和平与人类民主进程都将受到严重威胁。
文明之间无冲突只有竞争
西方知识界对伊斯兰有很多批评，其中最严厉的，是来自三位勇敢的女性。一个是出生
在叙利亚的苏尔丹（Wafa Sultan，后移民美国）。几年前她在半岛电视上跟毛拉们辩
论，痛斥伊斯兰教是野蛮、落伍、残暴，更是欺压女性的，轰动一时。她在电视上呼吁
阿拉伯女性觉醒∶“我想告诉每一个女性，伊斯兰男性... 阅读全帖 |
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j**********8
发帖数: 51 | 47 孕期可以做protein baculovirus expression 吗？还有retrovirus into MEF cells?
谢谢啦 |
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f******r
发帖数: 2975 | 49 the new top load doesn't have the post alligator(zhu4 zi3)
so it is pretty nice too
it won't hurt clothes
the review is very good
but I checked the MEF = 2.39 < 2.46
so it doesn't qualify our state's rebate
other front load machines dont have that good reviews
and most reviews say the front load might have mildew
or stinky smells as water is left
so very hesitated.
了。
handy |
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f******r
发帖数: 2975 | 50 我肯定是不会再在sears买这些家电了
上次搬家的时候再sears定了冰箱
结果我把地址输错了一个数字
打电话过去改，被告知没有问题，
送货的打电话给我时候告诉一声就好了
结果等啊等啊等到送货的，结果没给我打电话约哪天上门
我就打电话给客服，问哪天送货
又提了哈兹这个地址的事情，结果必须要取消重定
就给我取消了，我白等了一两个礼拜
而且价钱也高了几百块钱，害得很久不能开火
后来就去lowes买了价钱质量客服都很好
网上订的时候没有coupon在手边
人家就让我到店里重新弄了一遍
这次洗衣机是看到别人说有很多rebates
电力公司的100，州政府的150
在华人上面研究半天，又看了HD很多的reviews
初步选定 LG topload 2501HW，网上评价非常好
打完折750左右，新的这种洗衣机没有那个棍子
所以不是很伤衣服，又克服了 frontload的缺点
比如水排不干净，震动阿
快定了发现MEF=2.39拿不到州政府的150，虽然
州政府的150页发完了，后面的人都在waiting list
但是毕竟还是150块钱阿
而且我又想买 steam的，因为这两个月我跟姑娘相继过敏... 阅读全帖 |
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