l********g
发帖数: 400 | 1 我在用 MG132 抑制剂去抑制一种蛋白的降解,试了好几个浓度和时间,都测不到这种蛋
白的积累. 有做过这种实验的同学能不能指点一下, 说说看有哪些窍门.老板在等结果
呀.
谢谢 |
|
h*********5
发帖数: 464 | 2 MG132 at a concentration of 10 μM for 12 h |
|
|
n*******l
发帖数: 75 | 4 各位大侠们，我在做用6ohda处理细胞的时候，发现一个蛋白的水平降低，文献表明可
能是proteasome（实验是过表达此蛋白，然后用MG132处理，发现蛋白增多；）或者
caspase降解（在细胞中过表达此蛋白和各种caspase酶,发现蛋白降解）。
我于是用proteasome inhibitor MG132与6OHDA 同时处理，并没有发现此蛋白水平回复
（保证MG132其作用，有阳性对照蛋白）。换用caspase inhibitor和6OHDA处理，也没
有发现次蛋白水平回复，换用lysosome inhibitor和6ohda同时处理，也没有发现次蛋
白水平恢复。
请教别人，说proteasome的inhibitor MG132 并不足以阻止proteasome。说一些好的杂
志都不接受MG132作为proteasome的inhibitor。是这样么、？那有什么好的推荐么？
另外一种可能行是我用药物处理之后，蛋白水平下调，是因为我的蛋白沉淀了，在我的
buffer里面是没有的。但是我是用cell signling公司的buffer20mM Tris， 150mM 氯
化钠，1... 阅读全帖 |
|
b******e
发帖数: 3348 | 5 借这个题目问sunny一个问题，
我研究一个药物对某蛋白的作用，已知此药物能都抑制蛋白在细胞内的accumulation，
并且知道该药物对蛋白的mRNAlevel没有作用，
因此想搞清楚该药物对蛋白是抑制protein合成还是促进protein降解.
我做了一个实验，发现使用mg132抑制蛋白降解以后，该药物依然能够阻止蛋白在细胞
内的积累。然后我就倾向认为该药物抑制了蛋白的合成，而不是降解。
但是我导师说mg132只是抑制部分proteasomes,而不是全部，而且protein degradation
不完全靠proteasome (我这方面不是很确定），所以可能该药物能够促进蛋白降解，不
过不是通过proteasome.感觉好像也有道理。
sunny能普及一下mg132的作用和protein degradation吗 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 6 蛋白降解一般而言可以至少有两个途径：proteasome, lysosome, 再加上limited
proteolysis by calpain or other proteases.
前者可以用MG132 or beta-lactone
中间可以用100mM NH4Cl
后者可以用calpain inhibitors
MG132 本身是一个小多肽模拟物，一般认为是堵塞chymotrypsin-like cleavage
activity. 所以其实也不是一个很干净的inhibitor, cross-react with calpain and
other protease. 但是它在浓度比较高的时候(20uM) 对proteasome 抑制
是非常明显的。
beta-lactone 主要通过和proteasome subunit crosslinking 而起作用，比
MG132 专一性稍微好一点点，但是抑制作用不是特别明显。
不管哪个inhibitor 都不能完全解决问题。我不能说你的导师到底是对还是错，
但是你应该找其他方法来佐证。比方说，你可以看看蛋白用这个东西处理的时候，
... 阅读全帖 |
|
v***a
发帖数: 1242 | 7 真是非常感谢！可以问一下，MG132的工作浓度你大概用怎么一个范围？那以后做超量
表达的时候是不是都要以MG132的treatment作为基础了？如果对其它因素有影响，怎么
来区分是不是因为使用了MG132的缘故呢？
6 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 8 MG132 在10uM 以上对proteasome抑制很明显。有些好的杂志不接受这个作为
单独证据是因为MG132 对很多其他蛋白酶也有抑制作用，所以需要其他证据
一起来confirm. 但是这个并不是你的问题的所在处。
你的情况下，你用6ohda 处理细胞有多久？用MG132又有多久？
另外，你的蛋白并不一定就是降解，有另外几种可能，一个是表达减少，
另外一个是分泌出去了。 |
|
b****r
发帖数: 17995 | 9 刚才有人发个western，用MG132，一个蛋白量不变，用cycloheximide蛋白量反而明显
增加，与大部分蛋白正相反，正要回答结果删贴了，还是把我的想法打出来看看大家的
看法
依稀中好像看到过这样的情况
我现在的想法是是不是这个蛋白主要不通过proteasome降解所以MG132无效，而这个蛋
白在你处理之前就已经合成了不少，而它的降解是通过 一种 fast turnover的蛋白酶
进行，所以用cycloheximide反而造成其量增加 |
|
r******k
发帖数: 446 | 10 MG132 可以inhibit proteasome degradation， cycloheximide是inhibit denovo
protein synthesis。
看了一些paper都是用这俩药，但是具体意义是什么呢？研究一个protein的half life
有啥意义？
MG132 还可以induce 一些蛋白的nuclear translocation，why？ |
|
r******k
发帖数: 446 | 11 非常感谢呀！ ！！ 但是加MG132 是不是必须是endoegous promoter 才有意义？ 如果
是transient expression我的两个蛋白的话 是不能用MG132研究他们的degradation的
对吧？
再次感谢！！ |
|
a*****s
发帖数: 131 | 12 If my protein is very rapidly degraded (MG132 can rescue), how can I enhance
its expression in stable cell lines to enhance its function? MG132 is so
toxic to cells. |
|
X*********4
发帖数: 50 | 13 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: smc0612 (smc), 信区: Biology
标 题: 曝料：造假太恶劣，触目惊心！
关键字: 学术造假、学术不端
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Jun 22 05:25:05 2014, 美东)
刚与国内一好友（也算个大腕评委，嘿嘿）聊天，他收到一封有关严重学术造假的
举报信。这个Whistleblower检举了今年新科杰青（已通过答辩）上海交通大学医学院
王建华的一篇文章，刚发表于Oncogene. 2014 Jun 9; doi: 10.1038/onc.2014.158. [
Epub ahead of print]. PMID: 24909173。全文总共有7张大图和on-line的10张补充图
，Whistleblower发现几乎每张大图存在大量的弄虚作假、学术不端，包括重复使用数
据、捏造数据和窜改数据。造假非常恶劣，触目惊心！有兴趣的下载来看看，呵呵。
下面是造假要点：
(1) 在图2C，对照组集落形成实验：MCF7/CAF18-CM的图经左旋转90°后，与MCF7的图
像一样。
... 阅读全帖 |
|
s******r
发帖数: 2876 | 14 加上MG132行不行？
I tired that, and found out not suitable.
It takes at least 20 to 30 minutes to completely disrupt all the actin
filaments, but my target protein has a half time much much shorter than that
. |
|
s******y
发帖数: 28562 | 15 芬特，我们本来就是要做pulse chase,
加上MG132就完蛋了。
that |
|
s******y
发帖数: 28562 | 16 Promega, TnT T7 coupled transcription/translation kit
Depending on what degradation system was responsible. In vitro translation
system also contain ubiquitin and proteasome. However, it does not have
lysosome or golgi (which also contains protein degradation machinery).
You can add 10uM MG132 in the in vitro translation system (or your 293T cell
culture medium) to inhibit the proteasome.
的系统更容易降解我的蛋白？
Yes. If you want, you can try bacterial in vitro expression system. BUT, it
won't contain the |
|
s*******g
发帖数: 3332 | 17 你确定这个蛋白是通过proteasome来降解的么？ |
|
|
l********g
发帖数: 400 | 19 Thank you. I had tried 30, 50, 100 uM for 6 h but not work |
|
l********g
发帖数: 400 | 20 Thank you. I had tried 30, 50, 100 uM for 6 h but not work |
|
|
h**********8
发帖数: 650 | 22 I use 20 uM for 3 hours
By the way, have you seen the poly Ubiquited shift form? |
|
h****r
发帖数: 152 | 23 很有可能是泛素化途径降解，拿MG132处理下就知道啦 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 24 上个月在他们公司买的cycloheximide 粉末，大家用了都觉得结果不太对头。
结果这两个星期我亲自去用了几次，发现根本就没有效果！随便几个很简单的
internal control 都不降解！
这个烂公司，真的是一天比一天烂了。以前我还觉得他们是大公司应该质量不错，
没想到那么多糟糕的产品，去年他们的MG132就坑了我一次，现在又弄这个。
我都忍无可忍了，我还要赶实验呢，这么华丽丽的来浪费我的时间！
版上有没有用过其他公司的，比较可靠的cycloheximide?
谢谢了！ |
|
s******y
发帖数: 28562 | 25 还没有，但是我有点懒的去理他们了。去年我和他们抱怨那个MG132的时候，
他们顶了我一句说：他们的产品说明里从来都没有把那个标为纯合物，所以不能
退钱也不能换货。我当时真的是被他们噎住了，因为从法理上来说，他们的那个
说法没有任何问题。
所以这次我去抱怨，估计也是同样下场。所以我真的懒得去花这个时间找气受。
干脆找另外一个可靠的公司去订产品算了。
真的很让我心寒，我以前用他们的产品用了将近十年了，没有料到这两年他们的质量
管理和客户服务如此的江河日下。就像你说的那样，连那么一个普通的化学物都
能搞错，真的让人失去信心 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 26 谢谢！
我去年在Sigma 订的MG132出问题的时候也是转向这个公司订的。
听你和另外一个同学这么一说，我打算cyclehexmide 也向他们订了。
希望这次不要再出问题了。。。我已经受不了更多的打击了。。。
). |
|
D******9
发帖数: 2665 | 27 有个蛋白，在A和B细胞系都能检测到mRNA的表达， 表达量差不多(RT-PCR, realtime
Ct value about 24),应该说RNA level还是挺高的， 但是在A中表达量很低， 几乎检
测不到， 而在B中表达量却很高， 我用MG132处理了A细胞系，蛋白量没有增高。DNA
sequencing显示coding region是一模一样的。 请教大家有什么可能性？ 谢谢， |
|
l****o
发帖数: 442 | 28 体内实验我也做过，呵呵，我用过MG132抑制过12小时以上的，浓度10微摩，细胞并没
有死。 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 29 如果处理时间过长，两者都会引发细胞调亡。
一般不宜超过8个小时。
抑制蛋白合成之后，是有可能间接的使得某些蛋白的降解受到影响。所以一般不能
仅仅用cycloheximide 的数据来说明问题，而是必须有其他辅佐手段来佐证。
比方说用pulse labeling, or MG132 treatment |
|
k****o
发帖数: 589 | 30
谢谢sunny！看来它们的细胞毒性和我估计的近似。不过还有些疑问想和你探讨一下：
1. 这两种抑制剂应该不适合研究半衰期长的蛋白和mRNA吧？有没有毒性较小的替代抑
制剂？
2. MG132是proteosome抑制剂，为什么可以用它来支持cycloheximide的数据？
3. 研究蛋白和mRNA半衰期，除开放射性元素的pulse-chase，还有没有什么不用同位素
的办法？
多谢指教！ |
|
|
s******y
发帖数: 28562 | 32
抑制剂？
这两个已经几乎是最好使的了。要研究半衰期特别长的话就只能上同位素了
有人已经说了，就跟下水道塞子和龙头的关系一样。如果一个蛋白降解得快的话，
用MG132会导致它出现积累，相对于不降解的蛋白就会有比较大比例的升高。
当然，你不能同时加cycloheximide，否则就成了左脚踩刹车右脚踩油门了
还可以用其他方法标志的氨基酸或者核酸。比方说我记得某个公司（either promega
or Ambion) 有卖用biotin 或者荧光标记的amino acid/Nulceotide kit, 似乎可以用
来做pulse-chase |
|
K*o
发帖数: 96 | 33 有可能是降解太快了，你下次做Transfection的时候，多做一个孔，然后在收细胞前6
个小时加MG132。看看如果抑制降解这个蛋白是不是就能在Western上看到了。
我自己就曾经遇到一摸一样的问题，troubleshooting这个那个的，白费了我好大功夫
。 |
|
K*o
发帖数: 96 | 34 我一般用的是10mM. 只能用几个小时，过夜的话，细胞就都全死光了。
所以不能在试验的时候加MG132.不过如果你发现确实是因为蛋白降解太快导致的话，只
能Mutate关键位点，让它变稳定些。 |
|
n*******l
发帖数: 75 | 35 多谢啊，我用6ohda有8个小时，MG132(10uM)也是提前处理半个小时，然后再加入6ohda的啊。
而且我检查过此蛋白的mRNA的水平，是上调的。
另外，如果是翻译水平上减少，这个要怎么证明呢？我的蛋白应该不是分泌性的蛋白啊，没有看到过，你的意思说我应该弄点培养基看看是否有此蛋白呢？还是怎样啊？ |
|
g*********5
发帖数: 2533 | 36 10uM lactacystin?
MG132 20um？ |
|
|
t******y
发帖数: 716 | 38 如果蛋白N端有信号肽，Flag连着信号肽，信号肽的切除不是100%，但也是绝大多数，
如果碰到这种情况检测不到就很正常了。或者下次你用MG132来抑制蛋白降解。看看目
标蛋白的量是否上去。 |
|
h****r
发帖数: 152 | 39 把载体测个序检查阅读框是不是对的，有没有缺失或插入。
如果没问题，你就发了。发现一个非常不稳定的蛋白。拿MG132处理下，看看蛋白是不
是稳定那 |
|
f*******e
发帖数: 354 | 40 求教：
手里研究的A蛋白影响了B蛋白的蛋白水平，但不影响mrna水平，本想做降解的，MG132
虽然可以恢复一部分，但是就是内源性降解曲线（CHX）没有明显差异。现在想要不要
转向翻译水平，但是没有full length 的mrna，只有coding区，因为也不知道是否在非
编码区的调控，所以单独试coding区意义不大。
所以如下假设，不知道有没有可能。
先将原核表达纯化的蛋白（如GST和GST-A）加入到IVT系统中，再加入相同ug的细胞
total mRNA,翻译一定时间后Western检测B蛋白，不知道这样是否可能，有没有达人做
过，一般都是特定的mrna，这样总rna会不会目的基因拷贝数太少而检测不到。
非常感谢！ |
|
a*****x
发帖数: 901 | 41 加点MG132，或者共转点Ub，看有没有增加。 |
|
o**d
发帖数: 3080 | 42 如果H蛋白本身是E3 ligase，自泛素化的可能性就很大。但也有可能只是个泛素化的底
物。如果MG132处理之后，H蛋白的量增加，说明很很可能是K48－ubi，如果没有增加，
也有可能是K63－ubi。 |
|
r*****t
发帖数: 4793 | 43 自己偷偷做的东西，因为老板不喜欢
一个蛋白A，调节转录。可以和另一蛋白B结合。
偶然发现，A的突变体a(仍然可以结合B），导致细胞中B蛋白减少。这种调节不是转录
水平的，因为RT-qPCR和RNA-seq都表明，A和a都不带来B基因转录的明显变化。
考虑是蛋白降解水平的调节，用MG132 处理也确实发现，a不再导致B的下降。可是B蛋
白水平的恢复并不伴随其泛素化的增加。试着看了看是否a改变B与某些E3 ligase的结
合，结果也不理想。
不知道怎么做下去了。还不能问老板，it对我这个小项目一点都不喜欢。shit |
|
f*******d
发帖数: 92 | 44 我们想证明在某种treatment 条件下，NfkB pathway turned on by proteosome
degradation of IkBalpha. 老板说一定要S 35 labeling＋MG132，然后再IP，看
IkBalpha 的ubiquitination 才能证明它是走的那个pathway. 有什么办法可以绕过这
个实验，还是得到同样的结论呢？ 最近想生宝宝，实在不想做这种放射性的实验阿。 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 45 不需要阿。
可以用cycloheximide + Westernblot
MG132 + 6xHis-ubiquitin pulldown |
|
f*******d
发帖数: 92 | 46 不能转染，因为要用原代细胞。做western本来能看到IkBalpha已经下降了，但是敏感
度看不到unibiquitination. 所以老板说，要用S35 来提高敏感度。我是觉得，如果加
了MG132，能看到IkBalpha stabalization，那就说明它走的是proteosomal
degradation pathway阿， 为啥一定要看到ubiquitination呢。 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 47 你的老板是对的，看到带升高未必就是走ubiquitin pathway, 不过倒也
不需要用S35 （用了也未必有说服力，因为高分子量的smear未必就是ubiquinylated
band，审稿者要挑毛病还是很容易的）
你可以在MG132 处理（以及对照）的情况下直接pulldown IkBalpha, 然后用anti-
ubiquitin直接来看pulldown product 上的ubiquitin signal。至于抗体，推荐你用
Millipore monoclonal anti-ubiquitin。 这个方法就比较无可挑剔了，也不涉及放射
性。 |
|
F******p
发帖数: 2099 | 48 S35 is not necessary, only make things complicated.
MG132+IP+Ubi western is enough |
|
y***y
发帖数: 709 | 49 Poly-ub要看到也不麻烦，用MG132处理就可以看到了。 |
|
g******o
发帖数: 96 | 50 如果加入MG132，一个蛋白在WT细胞中积累，在KO（另一个调节蛋白KO cell line）细
胞中反而降低，该如何解释呢？ |
|
