s******s
发帖数: 13035 | 1 //nod. 这样说吧，analysis找个合作的就行了，挂个作者不花钱，
其实对方也不耗什么精力。一个library加上run大概$2k+? 自己做
是不现实的。多个sample可以multiplex，但是library和kit收费
会更多。自己做PCR成本大概$1k, 想用方便的probe enrich至少$10k.
所以自己做PCR，自己测序，大概$2k就能搞定
自己PCR， 找人用next-seq，大概$10k以内，而且其实更费时间
用enrich, 找人next-seq, 最方便，大概要$20k |
|
h******y
发帖数: 351 | 2 Panomics/Affymetrix的QuantiGene® Plex 2.0 Assay - Multiplex Gene
Expression Analysis说是可以在96孔板的一个孔里同时检测3-36个基因的mRNA表达水
平。
有没有用过的同学介绍一下经验？这个Assay是不是象宣称的那么灵敏？费用贵吗？
多谢！ |
|
t*d
发帖数: 1290 | 3 biological replicates 不一定比 technical replicates 更有意义。有些时候我们就
是希望知道technical replicates 的variation。
比如有人想做基因表达普，找差异表达的基因。一般现在第一个问题就是用microarray
还是 RNA-seq。如果目的是找差异表达基因，那么variation between technical
replicates 直接影响到 statistical power。如果同样两份细胞，通过 RNA-seq 流程
做出来（包括建库）的variation 比通过 microarray 流程做出来的variation 大，那
就是用microarray 做更好了。
那种之比较不同 lane 之间的 variation 对生物学家来说，没有什么现实指导意义。
另外，现在不少人认为 RNA-seq 成本已经将下来，和microarray 差不多了。可是这个
成本的下降是通过barcode multiplex 来实现的的。所以要比较 RNA-seq 和
microarray，最好能在同成本的条件下比。 |
|
H*******g
发帖数: 321 | 4 这个是sequenom的网站上关于genotyping的介绍。这个方法最多可以把40个SNP
multiplex在一个pool里面，对于你们要做的这种genotyping比较适用。Illumina也有
低通量的genotyping的array，你也可以试试看。Taqman也有genotyping的assay。一般
他么的网站上都会介绍。具体要看你们那里的core facility喜欢用哪种了。 |
|
s******s
发帖数: 13035 | 5 30M就不要省了。200M的可以multiplex一下
因子。 |
|
Q**********r
发帖数: 214 | 6 Cold Spring Harb Protoc. 2010 Jun;2010(6)
Illumina sequencing library preparation for highly multiplexed target
capture and sequencing.
Meyer M, Kircher M
PMID 20516186
please send to a*************[email protected]
thanks a lot |
|
s******s
发帖数: 13035 | 7 对呀。array最后通通要q-pcr验证，多做几组其实不比seq便宜。
再说seq现在可以multiplex, 做expression profile这种，一条Lane
上搞个十个八个都没问题，折合一个sample其实不到200，不算人工 |
|
c*****g
发帖数: 66 | 8 "Back to your RNA-seq data, if you only want to identify
differentially-expressed genes tha t are well-annotated. you would rather
put money on doing single-end sequencing (~50bp) to as deep as your budget
allows. "
这不是真的。。。
2 x single-end sequencing 比 1 x paired-end sequencing 在同样的throughput下
贵不少。所以在他的预算允许的情况下，应该做paired-end，甚至应该做multiplex来
消除lane effect etc.
真要做well-annotated genes，还搞啥sequencing，直接就array算了，不知道省多少
事。
array
analysis
dataset
identify |
|
f*******e
发帖数: 628 | 9 能被不同的激光波长激发当然是个优势啊。比如你同时还要看另外一个 green 的标记
，这样只要用同一个绿的激光激发，然后两个不同 emission 颜色可以根据波长来分别
检测，可以 multiplexing。
通常 488 是指 blue, 532 是 green,在这两个波段，看光谱，的确都有不弱的激发。
但是 emission 不管是哪个 laser 激发，都还是那同样的在 600 的峰。 |
|
A******y
发帖数: 2041 | 10 Around 50K if you want to do multiplexing, <30k if you just do standard ECL.
Alpha Innotech's top of line system I think it is still the best (but that
could be a personal opinion). Bio-rad should be the cheapest but also has
the lowest resolution and flexibility. I'm currently having access to Alpha
Innotech (very old one) and a GE system, which are not bad (we bundled with
GE InCell so I don't know exactly how much it costs). |
|
l**********1
发帖数: 5204 | 11 RE LZ
pls go to
one review,
by Rousserie G et al. (2010)
Semiconductor quantum dots for multiplexed bio-detection on solid-state
microarrays.
Crit Rev Oncol Hematol. 74: 1-15
web link:
HTTP ://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19467882 |
|
s******s
发帖数: 13035 | 12 sanger不贵啊。一人两个applicon，也就四块板子，一千多。
你搞NGS multiplex做死你，而且贵的多。 |
|
u*********1
发帖数: 2518 | 13 如果你不是做技术开发，就直接的PCR+sanger sequencing
尤其因为你的样本不多，而且只做一个基因（当然一个基因或许有multiple的exon）
如果你要做比如3000个sample，同时做40个基因，那这个方法肯定就不行了，
最先进的办法请看：
Multiplex Targeted Sequencing Identifies Recurrently Mutated Genes in Autism
Spectrum Disorders
http://www.sciencemag.org/content/338/6114/1619.abstract
当然未来whole exome测序的成本变得非常非常低的时候，这方法估计也要淘汰
btw，上面的science paper测了几千个样本的44个基因，最后也就发现6个recurrent
de novo mutated gene，也只能解释1%的sporadic ASD，所以我觉得disease genetics
还是任重道远 |
|
j****x
发帖数: 1704 | 14 可见的未来，whole exom测序成本就算再低，我觉得也不大可能直接应用于数千级别的
样本量，Multiplex Targeted Sequencing的策略应该很难被淘汰
Autism
genetics |
|
f*******2
发帖数: 14 | 15 Using PacBio RS. PCR multiplex all sample. A single sequencing run could
have enough coverage for the mutation detection. more info:http://www.pacificbiosciences.com/applications/target/
I can work with you for your sequencing project. total price would be less
than 1000 |
|
f*******2
发帖数: 14 | 16 Recommend using PacBio sequencer. multiplex all 100 cases with barcodes, PCR
amplify the whole 8Kb. A single smrt cell can generate enough sequence data
for the mutation detection. better than regular Sanger sequencing.
Contact me if you need more info. |
|
s******s
发帖数: 13035 | 17 要求科普。pacbio的multiplex这么容易做么？
PCR
data |
|
f*******2
发帖数: 14 | 18 对于LZ的项目，用PacBio的成本要比Sanger sequencing少。
multiplex是在PCR step. Barcodes can be added at the 5' end of both forward
and reverse primers for each sample. After PCR, purify and pool the
amplicons together with equal amount. Making one PacBio library with the
pooled sample and run one SMRT cell. Total price about 500 for PacBio
sequencing. The total throughput is about 100Mb per smrt cell with about 20-
50K reads.
LZ的200个PCR pool, 每个至少有100x coverage. 应该可以检测到50% or 100%突变. |
|
f*******2
发帖数: 14 | 19 要用NGS，估计还真没什么比这更简单的multiplex方法。比常规PCR后sanger
sequencing优势主要在throughput。样本量大当然就更合适了。再一个，如果突变率低
，Sanger direct sequencing PCR products很难检测到。 |
|
s******s
发帖数: 13035 | 20 常规测序只要一个pcr，测序的时候引物不一样就可以了，当然8k不好批。
这种multiplex我也用过，觉得比这个情况更合适。当时是检测三种状况
下十几个基因甲基化情况。甲基化一般每段都要是克隆测序，比较烦，但是
同时不关心具体是哪个克隆。所以，我的做法是，每个基因选个两三段pcr
出来，混一起，然后用某种dnase打成小片段，然后每种状况加一个barcode,
最后就只是triplex。 |
|
N****n
发帖数: 294 | 21 Any body has access to the following paper in .pdf format?
Multiplex Illumina Sequencing Using DNA Barcoding
http://www.currentprotocols.com/WileyCDA/CPUnit/refId-mb0711.ht
Publication Name: Current Protocols in Molecular Biology
Unit Number: Unit 7.11
DOI: 10.1002/0471142727.mb0711s101
Online Posting Date: January, 2013
Appreciate it and will send you BAOZI! |
|
l*********1
发帖数: 351 | 22 外行小白请教下：
RNA-programmed genome editing in human cells
RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9
Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems
“It’s too early to declare total victory” over TALENs and zinc-fingers,
Church said, “but it looks promising.”
是不是说TALEN engineering的坑就不用跳了啊？多谢指教。 |
|
l**********1
发帖数: 5204 | 23 RE:
adeno (天夺其魄) 的post:
不是吧,
Jennifer A. Doudna HHMI
UC Berkeley组 &瑞典于默奥大的 Charpentier组的 manuscript 被 Sci magazine
accepted for publication
2012 summer n天后的
conference 上 Emma Charpentier (she) will like to note it, isn't it?
Feng Zhang 的2013 Sci magazine paper adeno (天夺其魄) 您看了全文后
看了全部references 它们的whole abstract parts 了吗?
pls refer
Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems
Science. (2013) 339: 819-23.
by
Le Cong F. et al. and Feng Zhang
web link:
>HTTP://www.ncbi.nlm.nih... 阅读全帖 |
|
l**********1
发帖数: 5204 | 24 RE:
adeno (天夺其魄) 的post:
不是吧,
Jennifer A. Doudna HHMI
UC Berkeley组 &瑞典于默奥大的 Charpentier组的 manuscript 被 Sci magazine
accepted for publication
2012 summer n天后的
conference 上 Emma Charpentier (she) will like to note it, isn't it?
Feng Zhang 的2013 Sci magazine paper adeno (天夺其魄) 您看了全文后
看了全部references 它们的whole abstract parts 了吗?
pls refer
Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems
Science. (2013) 339: 819-23.
by
Le Cong F. et al. and Feng Zhang
web link:
>HTTP://www.ncbi.nlm.nih... 阅读全帖 |
|
i*****i
发帖数: 154 | 25 我们想做的是LncRNA的差异表达，本来打算用array来做的，比起传统的array，LncRNA
的array还是很贵的。但是我们觉得RNA-Seq能够得到更多的信息，而且作Multiplexing
的话，一个lane可以做4-6个sample。
不过刚入门，或者说还没有入门，没有经验。
我们用Core的service。
他们提供两种flow cell，一种是8个lane的Hi-Seq2000，每条lane能得到180M的reads/
Clusters。如果是pair end的话，当然还是180M的clusters，但是reads就加倍了。另
外一种是HiSeq2500，2-lane的flow cell，rapid mode，大概能出300M的reads/
clusters, PE cluster不变，reads加倍，当然价钱也比较贵，但是turnaround time很
快。
就传统的8个lane的Hi-Seq2000而言，一个sample大概能拿到40-50M的数据（cluster）
，pair end测序的话，大概80M左右（两次测序算两个reads，但是他们来源
于一个clu... 阅读全帖 |
|
M*P
发帖数: 6456 | 26 测的再多也用处不大，除非你能用什么手段去enrich lincRNA. 因为lincRNA表达都很
低，你测的read里面大多数都是coding gene/ribosomal RNA，基本上都浪费掉了. 之
所以有人用array，就是因为这个问题。我们最近刚做过，上千个已知lincRNA里，只有
一二百个表达量超过 1 read per million.
你不如先试试 pcr，看看一些已知的lincRNA在你的 tissue里是否表达，然后跟一些已
知的house keeping mRNA比比表达量，你就知道想用RNAseq直接全把lincRNA测出来是
不可能的 。
LncRNA
Multiplexing
reads/ |
|
j*p
发帖数: 411 | 27 1. 如果只想测量已知lncRNA的表达量差异，80M 101bp 应该够了，如果是human 样品。
2. 如果想发现新的lncRNA，200M 101bp比较合适（这也得看你做的体系是否比较特别
，如果是，那应该会有novel lncRNA）。
3. biological replicates比一个样品测得深来得重要。理由(a)transcriptome
assembly已经不是什么新闻，没有novelty；(b)有replicate才有statistics，forget
about cufflinks p-value with only one replicate；(3)如果细胞是in vivo 或者从
组织来，replicates' variation 会比你想象的大。
4. 如果是用ribo 0，reads打75折。
5. 如果是做strand specific library，不要用那种号称4小时就能做完的kit，我看过
不少于5个不同实验样品，很明显可以看到90%reads在正确的strand上，10%在错误的
strand 上（很难判断是在反链上还是由于反链没有除干净）... 阅读全帖 |
|
l**********1
发帖数: 5204 | 28 if can share instrument to do high throughput sorintg
pls try
BD Fortessa Flow Cytometer
//www.fluofarma.com/pageseditos,89,left_2354BC5D,high,throughput,flow,
cytometry,automated,confocal,imaging,laser,scanning,cytometry,high,
throughput,fluorometric,imaging.html
>Spec:
► Functional measures using an automated 384-well plate flow
cytometer
► Multiplexing analysis: measures up to 18 parameters simultaneously
in single cells
► Large Capacity: acquisition of 40 000 events per s... 阅读全帖 |
|
l**********1
发帖数: 5204 | 29 pls try Multiplex PCR by A, B and C three primers set (below figure that
X, Y, Z as A, B, C primers)
PMID 19936220
Generation and characterization of mice carrying a conditional allele of the
Wwox tumor suppressor gene. (2009).
PLoS One. 4: e7775.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19936220
or refer
Biology版 - 有没有可能出现假KNOCKOUT的情况?
hashuoy
2010-09-09 13:52:31
来自: 192.168.
1从公司订制的KO老鼠,带CRE基因,大半年折腾下来去掉CRE并拿到大量杂合子,按照公司
给的DATA SHEET, GENOTYPING双引物鉴定老鼠各基因表型正常,符合孟德尔遗传,但在对
培养的野生型和纯合子MEF细胞鉴定时,我发现虽... 阅读全帖 |
|
h******y
发帖数: 351 | 30 Jaenisch lab最新发表的利用CRISPR同时敲除5个基因的文章。CRISPR前途无限啊。再搞
出几个inducible的CRISPR就更厉害了。
One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/C
as-Mediated Genome Engineering
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23643243
Cell. 2013 May 1. pii: S0092-8674(13)00467-4. doi: 10.1016/j.cell.2013.04.02
5.
One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/C
as-Mediated Genome Engineering.
Wang H, Yang H, Shivalila CS, Dawlaty MM, Cheng AW, Zhang F, Jaenisch R.
Source
W... 阅读全帖 |
|
D*a
发帖数: 6830 | 31 multiplex，milipore有卖的
准不准就不好说了，你看具体的试剂盒发表文章的多少吧。 |
|
y****i
发帖数: 2194 | 32 millpore往往在各大学校都有公用仪器 你买了他们的kit就可以免费用
试剂也不是很贵
做过6个multiplex的大概1k出头多
如果是第一次买还有一个一次性的50% off coupon
比作elisa还是方便快捷多了 当天就可以出结果 |
|
b*********b
发帖数: 64 | 33 我们做multiplex做的很多，而且我们基本上都是买millipore的，Bio-Rad得知后就来
找我们老板，说要给我们50% discount，所以是他们找上门的。millipore比bio-rad好
的是，他们能做32-plex，不过我一般都用不了那么多，所以我一般自己customize，挑
其中一部分cytokines，这样可以省很多钱。
我跟millipore打过很多交道，也和别的很多公司打过交道，他们都蛮好讲价的。当然
老板出马会更容易些。不过就我这小虾米，他们也都很客气，问了都会给。他们的利润
很大，像20%的discount对他们来说就是小意思。我每次买东西，要是价格超过$1000，
都会给他们写信，先把他们的products赞一遍，然后说price有点高，能不能给个
discount，他们给的discount一般都是25%，20%。我到目前为止还没遇到问了不给的。 |
|
z*********8
发帖数: 1203 | 34 可以用barcode然后multiplex sample么？你那个30m是illumina miseq吧？如果你用
hiseq2000或者2500的话，至少120－150million reads，我只做过一次，但是有
200million reads |
|
s******r
发帖数: 1245 | 35 RNA-seq一条lane又不是只跑一个sample，multiplex一下上四，五个不是问题，狠一点
的十几个挤挤也凑活，啥array这么便宜，一般不都得好几百
如果只看一个gene panel的话也许array稍稍有点优势，看全transcriptome的肯定是
seq更好，没听说过啥问题array能做的比seq好的，要扯false discovery难道array就
没有，只会更糟
seq |
|
h****u
发帖数: 618 | 36 需要买一台PCR 做 mRNA 和 microRNA expression. 以前一直都用 Applied biosystem
StepOnePlus™ PCR, 但是最近看到 Bio-Rad CFX96™ 不需要calibration
,但是StepOnePlus™ 是需要买calibration kit的。不知道哪个更好用呢？如果
两者性能相当，买 biorad 就一劳永逸了。
而且听sales 说， biorad 使用5个led 激发， steponeplus 只有一个蓝色led， 所以
做Multiplexing的话，是不是biorad 更好呢？
另外在 biorad 上使用 taqman 的试剂会不会有问题呢？
请大家指教。非常感谢！ |
|
m******g
发帖数: 467 | 37 Science 14.03.21
推荐：
1. Highly Multiplexed Subcellular RNA Sequencing in Situ
稍微了解一下：
1. Epistasis and Allele Specificity in the Emergence of a Stable
Polymorphism in Escherichia coli
小知识：
1. From Parasitism to Mutualism: Unexpected Interactions Between a Cuckoo
and Its Host
Lower predation-induced falure due to repellent secretion by cuckoo chicks
2. Humans Can Discriminate More than 1 Trillion Olfactory Stimuli |
|
l******u
发帖数: 936 | 38 http://investor.illumina.com/phoenix.zhtml?c=121127&p=irol-news
Illumina’s MiSeqDxTM Receives FDA Premarket Clearance with Two Cystic
Fibrosis Assays and Universal Kit for Open Use
Premarket Clearance is an Industry First for a Next-Generation Sequencing
System
SAN DIEGO--(BUSINESS WIRE)--Nov. 19, 2013-- Illumina, Inc. (NASDAQ:ILMN)
today announced that it received premarket clearance from the U.S. Food and
Drug Administration (FDA) for the MiSeqDx system, the first high-throughput
DNA sequencin... 阅读全帖 |
|
a********k
发帖数: 2273 | 39 哎，最后也只是approve了一个139的genotyping测试
比传统的multiplex PCR的genotyping贵，慢。保险公司也不多报销一分钱。
and
throughput
FDA |
|
a*****i
发帖数: 679 | 40 multiplex PCR 检测20个基因的point mutation，用的magnetic beads。模板是human
genomic DNA。有什么建议吗？ |
|
y***k
发帖数: 40 | 41 终于有人忍不住下手了，可是到哪里找业务去喂饱这个巨兽呢
=================================================
SAN DIEGO & SHANGHAI--(BUSINESS WIRE)--Mar. 10, 2014-- Illumina, Inc. (
NASDAQ:ILMN) and WuXi PharmaTech (Cayman) Inc. (NYSE:WX), a leading
pharmaceutical, biotechnology, and medical device R&D outsourcing company
with operations in China and the United States, today announced that the
WuXi Genome Center has purchased an Illumina HiSeq X Ten sequencing system.
This new investment will enable WuXi’s clinical genomic ser... 阅读全帖 |
|
a***y
发帖数: 19743 | 42 it is not a PCR
it is not based on DNA
it is based on the presence of the bacteria: 1CFU/ml.
I am sure it can multiplex.
It is for clinical Dx not for research so it does not need "hypothesis free"
.
t |
|
m******g
发帖数: 467 | 43 刚刚才看到这篇文章，拖延症伤不起啊。
我觉得那个鱼的系统用来做epigenetic analysis，特别是跨代的影响什么的应该会很
有趣呢，最近不是有很多这方面小鼠的文章嘛。
Nature 14.05.13
推荐：
1. How to tame the flood of literature
文献阅读的工具推荐
2. Evolutionary developmental biology: Dynasty of the plastic fish
3. Biological techniques: Edit the genome to understand it
原文：Saturation editing of genomic regions by multiplex homology-directed
repair
稍微了解一下：
1. There is life after academia
10% of the 86,000 current biology PhD students in the United States will
become tenure-track fac... 阅读全帖 |
|
m******g
发帖数: 467 | 44 刚刚才看到这篇文章，拖延症伤不起啊。
我觉得那个鱼的系统用来做epigenetic analysis，特别是跨代的影响什么的应该会很
有趣呢，最近不是有很多这方面小鼠的文章嘛。
Nature 14.09.04
推荐：
1. How to tame the flood of literature
文献阅读的工具推荐
2. Evolutionary developmental biology: Dynasty of the plastic fish
3. Biological techniques: Edit the genome to understand it
原文：Saturation editing of genomic regions by multiplex homology-directed
repair
稍微了解一下：
1. There is life after academia
10% of the 86,000 current biology PhD students in the United States will
become tenure-track fac... 阅读全帖 |
|
m******g
发帖数: 467 | 45 Nature 14.11.27
稍微了解一下：
1. Multiplex single-molecule interaction profiling of DNA-barcoded proteins |
|
m******g
发帖数: 467 | 46 Saturation editing of genomic regions by multiplex homology-directed repair? |
|
W*****6
发帖数: 2 | 47 Please drop a note if you see fit. Thanks.
Requisition ID: WD20816
Position: Full time
Open date: Mar 11, 2015 5:30:58 PM
Functional area: Science and Technology
Location: Collegeville, Pennsylvania
Required degrees: Bachelor's Level Degree
Experience required: 5 years
Relocation: No
Basic qualifications:
• BS with >5yrs or M.S. with >3yrs experience in cancer biology,
cancer immunology or related field
• Extensive knowledge of and experience in phenot... 阅读全帖 |
|
c*******0
发帖数: 190 | 48 Opening Remarks
Dr. Edward Benz，
CEO of Dana-Farber Cancer Institute, Harvard
Medical
School
Technology Innovation
Xiaoliang Xie,
Professor, Harvard University, Member of National
Academy of Sciences
Life at the Single Molecule Level
Yi Zhang
, Professor, Harvard Medical School,
Investigator of
Howard Hughes Medical Institute
Understanding Active Demethylation and SCNT through Tool Development
Feng Zhang,
Assistant Professor, Massachusetts Institute... 阅读全帖 |
|
l********e
发帖数: 415 | 49 Plan 3 (Best Solution):
multiplex 20 samples in each lane
|
|
e****l
发帖数: 115 | 50 http://jmd.amjpathol.org/article/S1525-1578(15)00046-X/abstract
Journal of Molecular Diagnostics
May 2015 Volume 17, Issue 3, Pages 273–283
Accurate Classification of Germinal Center B-Cell–Like/Activated B-Cell–
Like Diffuse Large B-Cell Lymphoma Using a Simple and Rapid Reverse
Transcriptase–Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification Assay
A CALYM Study
Please send to [email protected]
/* */
Thanks so much!! |
|
