g*b
发帖数: 60 | 1 Web of Science 上查得 Fu J and Yan SD 所合作的文章。其中 Yan SD 是大多数文章
的通信作者。
要查真相，为何不向这个通信作者写 email 询问呢？
Title: An intracellular protein that binds amyloid-beta peptide and mediates
neurotoxicity in Alzheimer's disease
Author(s): Yan SD; Fu J; Soto C; et al.
Source: NATURE Volume: 389 Issue: 6652 Pages: 689-695 Published: OCT
16 1997
Times Cited: 246 (from All Databases)
[ View abstract ] [ Hide abstract ]
2. Title: Amyloid-beta peptide-receptor for advanced glycation endproduct
interaction elicit... 阅读全帖 |
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C*******g
发帖数: 9288 | 2 mutant好
survivor
ko...mutant! |
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C*******g
发帖数: 9288 | 3 以后叫你mutant
lol
mutant has superb dedication to science. haha! |
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m******e
发帖数: 536 | 4 In 1987, a mutant kitten was born in Montana with hair like a poodle. Named
Miss DePesto, this kitten grew up and birthed curly kittens of her own. As
the curly cat family tree grew, Miss DePesto's descendants eventually became
recognized as a new breed: the Selkirk Rex.
Now, 25 years and about nine kitty generations later, researchers at the
University of Veterinary Medicine, Austria, have confirmed that these
felines are genetically distinct from previously known breeds, making
Selkirk Rex the... 阅读全帖 |
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E*****m
发帖数: 25615 | 5 你相信那些變形得一榻糊塗的 mutant 是你的神控制的？
(有點衝動想貼些 mutant 的照片, 不過太噁了, 算了)
BELIEF).
pre-
Christianity, |
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a***e
发帖数: 829 | 6 偶用的是two-step PCR, 把要突变的点设计在一对互补的引物上，最好在中间，第一步用
normal ５' primer+mutant 3'primer以及mutant 5'primer+normal 3'primer分别得到基
因前段和后段的PCR产物，第二步用正常的5' and 3' primers 做引物，以第一步PCR的两
个产物为模板，得到含有突变的全长DNA，再clone到质粒上拿去测序鉴定就行乐。 |
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a****e
发帖数: 128 | 7 Thanks for the reply. I did everything exactly the same but still find
intensity variations between the wild type and the mutant sections. My
feeling is that the difference in expression level is small, if there is any
, between the wild type and the mutant. But I am just wondering if there is
there anyway to make a solid conclusion about the expression level
difference. |
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T**********t
发帖数: 1604 | 8 -74那个我发现最终还是序列弄错了，site-directed mutagenesis的时候，somehow
single mutant弄成double mutant了。其他三个我反复又对了几次sequence，应该没有
错误了。
现在就是-14的这个，我不知道是怎么回事。会不会是掉了一个甲基？ |
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t****p
发帖数: 1504 | 9 For example, if you randomly put insert into genome and cover/saturate all
of genes, therefore create a large mutant strains library. How to find these
essential genes?
If there is no any insert in a gene coding region from this mutant library,
we would say this is an essential gene. But how about all of insertions
happen at very c-terminal of the coding region? Would you still call this
essential gene? What is the standard? |
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p*****m
发帖数: 7030 | 10 fly RNAi也有off target effect啊，这个哪里都有 mammalian system也有
worm虽然没办法KO 但是你架不住人家mutant多啊 mutant+cell specific rescue在线虫
里是通用配置 基本可以替代老鼠的cKO了都 当然出发点不一样
相对来说反而是fly RNAi的efficacy好像还有点问题 至少在neuron里看起来efficacy就
很差 不知道是hpRNA设计的问题还是RNAi machinery整个就弱
most
with |
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S*****s
发帖数: 287 | 11 I think it is project dependent, and probably investigator dependent, so it
is my personal opinion here. In mammalian cells, GFP shows up as soon as it
is translated, so it can be hard to tell membrane expression from
cytoplasmic expression. In my study, the wild type protein had efficient
membrane trafficking, and mutant protein decreased trafficking efficiency.
GFP fusion protein was not able to show the weak membrane expression of the
mutant protein. When I used HA-tagged protein, I detected ... 阅读全帖 |
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o********r
发帖数: 775 | 12 Review
Many different tumor types have polyclonal tumor origin: Evidence and
implications
Barbara L. ParsonsCorresponding Author Contact Information, a, E-mail The
Corresponding Author
aDivision of Genetic and Reproductive Toxicology, National Center for
Toxicological Research, HFT-120, 3900 NCTR Road, USFDA, Jefferson, AR 72079,
United States
Received 7 February 2008;
revised 14 May 2008;
accepted 15 May 2008.
Available online 31 May 2008.
Abstract
Few ideas have gained such strong acceptance i... 阅读全帖 |
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w*e
发帖数: 740 | 13 初步打算先用酶消化，然后测试细胞的功能，目前已经成功
下一步：
想通过RT-PCR来确定我们测试的细胞是不是MUTANT细胞。
因为我们是CRE/LOXP老鼠，不能保证所有细胞都是MUTANT细胞，而且不同的细胞，表型
也不一样
谢谢
cell |
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p****p
发帖数: 3360 | 14 我的建议是再做一个pGL4.24-3'DNA的mutant construct，reshuffle 3'DNA片段中这个
TF的putative binding site。用这个mutant construct来代替 你的pCMV-TF和pGL4.24
cotransfection中的pGL4.24。理由还是3'DNA插入到pGL4.24会影响mRNA的结构从而影
响level，所以我觉得用pGL4.24本身做pGL4.24-3'DNA的negative control不合适。
12
paCMV-
pGL4. |
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A***i
发帖数: 50 | 15 Sorry that I did not say clearly.
If I transfect the mutant alone, see no current in electrophysiology. But if
I transfect the mutant with wt, see no diffence than wt alone. So it is not
dominant negative. But causing atrial fibrillation in human.
is
story |
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D*a
发帖数: 6830 | 16 晕，这个genotype不是普通的mutant还是wt的genotype么？
我以为是lz要看看mutant是不是影响某些rna，可能我理解错了吧 |
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f*****Y
发帖数: 20 | 17 胚胎是一个比cell culture复杂的多的系统，需要很多signaling的协调才能正常的发
育。而ES cells只是胚胎的一个cell lineage的culture adaptation，是一个简单的多
的系统。比如说，cdx2 mutant embryo因为trophectoderm defect 无法存活(
embryonic lethal E3.5-5.5), 但是cdx2 ES cells 是可能的。还有nanog mutant
embryo is lethal，Nanog null ES cells 据说可以proliferate many passages. |
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D*a
发帖数: 6830 | 18 这个很难笼统的说，我在你另一个帖子里回了，你本来就有background的问题，如果
control还不是一个爹妈出来的，很难比较，不光以后发表文章，你自己都有可能半路
上怀疑是不是实验设计的问题。你看看能不能拿a ＋＋ ，b＋＋，c＋＋，和a ＋＋ ，
b＋＋，c＋-配？这样一半是control一半是mutant。你三个基因，可以看看你想什么和
什么对照？不知道你跟你老板讨论过将来发表到什么杂志之类的了么？
还有发表文章档次的问题。我看见有的paper上三个control的，比如他们是交配一个
disease模型和一个基因的KO，就是有病的wt，没病的wt，有病的heterozygote，和没
病的heterozygote，其中有病的heterozygote是他们要证明的某基因对某病的作用。
我们现在做的一个疾病模型也是杂交很麻烦，我老板嫌太浪费钱，就让得病作为对照组
，得病加一个基因KO作为mutant组，打算这样来发表。但是我们还是留了一些KO没病的
老鼠，其实是想看看能不能做别的，所以我也不能肯定的说我老板不会中间改主意加一
组对照
啰嗦了一堆，也没给个答案，希望能有点用 |
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D*a
发帖数: 6830 | 19 我理解他说得是如果一只老鼠和一只KO搞的测量，就是n = 1, 如果增大n，要增大老鼠
数量。因此如果一次测量10只老鼠的血液某指标，那么n = 10
We could choose one mutant mouse and one wild type, and perform 20 replicate
measurements of each of their tails. We could calculate the means, SDs, and
SEs of the replicate mea- surements, but these would not permit us to
answer the central question of whether gene deletion affects tail length,
because n would equal 1 for each genotype, no matter how often each tail was
measured. To address the question successfully we ... 阅读全帖 |
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a********k
发帖数: 2273 | 20 花了一个小时，深深的鄙视一下自己的无聊行径！！
125 蔡亮 男 1980年11月 复旦大学 生命
科学 2007年12月毕业于[美国]北卡大学 [美国]加州大学旧金山分校 博士后
Cai L, Mostov K. Polarity is destiny. Cell. 2009 Nov 13;139(4):660-2. PubMed
PMID: 19914162; PubMed Central PMCID: PMC2900917.
Cai L, Makhov AM, Schafer DA, Bear JE. Coronin 1B antagonizes cortactin and
remodels Arp2/3-containing actin branches in lamellipodia. Cell. 2008 Sep
5;134(5):828-42. PubMed PMID: 18775315; PubMed Central PMCID: PMC2570342.
Cai L, Makhov AM, Bear JE. F-actin... 阅读全帖 |
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z*h
发帖数: 773 | 21 Brief Introduction of Biofuels Lab at Virginia Tech
“Imagination, Invention, innovation --- Replacing Crude Oil by Sugars
through Cascade Enzyme Factories”. Website: http://sugarcar.com
The mission of the Biofuels Laboratory led by associate professor Yi-Heng
Percival Zhang at Virginia Polytechnic Institute and State University (USA)
is to solve key sustainability challenges – What will replace crude oil?
How and when? How to feed the world in future? Dr. Zhang is a world
recognized young bioc... 阅读全帖 |
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a*******u
发帖数: 19 | 22 N-terminal fragment C-terminal fragment
——————————————— ————————————————
方案1：
引物设计如下
PrimerN_For: A$$$$$$$$$$$$$$
PrimerN_Rev: B**********
PrimerC_For: B&&&&&&&&&&&
PrimerC_Rev: C@@@@@@@@
A,B,C分别表示 不同的内切酶。
用分别将两端PCR下来依次插入到载体中，即N端以空载体为载体插入，然后将C端以N端
插入完毕的质粒做载体插入。这样的问题是多了一个B的内切酶序列，多2个aminos。
deletion mutants允许多2个外源的aminos吗？
方案2：
引物设计如下：
PrimerN_For: A$$$$$$$$$$$$$$
PrimerN_Rev: &&&&**********
PrimerC_For: &&&&&&&&&&&
PrimerC_Rev: C@@... 阅读全帖 |
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a*******u
发帖数: 19 | 23 如果我用6个碱基的内切酶序列替代300多的domain构建deletion mutant，这样的
deletion mutant用来做mapping以及功能实验 会不会被人质疑？ |
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p****y
发帖数: 95 | 24 Look at the recent Nature paper about the Na channel structure, not easy job
, >30 mutants tested, nearly 1,000 crystals measured, over 100 data
collected, hard work is key
Also look at YG's transporter structure in Nature a couple of years ago, if
i remembered correctly, >100 mutants tested, >800 crystals tested, anything
in CNS is not an easy job |
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A********2
发帖数: 107 | 25 If I understood your question correctly, you have inserted a Ab resistance
gene (linked to the mutation) into the mutant chr and were trying to move it
into wild type strain. Why not just make a phage lysate of your mutant
strain and then transduce the wild type strain. |
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T****O
发帖数: 407 | 26 Usually you want to replace an AA because it's critical in your hypothesis.
Therefore, any perturbation would generate significant consequences. And
you want that significance to be as large as it could be theoretically
allowed. Mutating Leu to Ala is of the general practice. "Ala Scan",
remember? You could swap on Ala in replace of anything. The only exception
is Ala itself, which you should replace with Gly.
Now, it's important to notice the word "general". In many cases, simply
replacin... 阅读全帖 |
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A******y
发帖数: 2041 | 27 If that's what you want to do, you have to do both positive mutant (Lysine
to arginine) and negative mutant. Although, how many copies of histone H3
are there in human? I know for histone H4 there are more than 14 different
coding regions. |
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p*****m
发帖数: 7030 | 28 还有，Sydney Brenner当年做screen找了一堆unc gene的时候，无非就是这些虫子爬起
来有点怪，他家难道还期待这些unc都是一个pathway的？ft。
worm screen找到的let mutant, yeast screen找到那些ste mutant，phenotype就是
lethal, sterile,按照你的理解，这是最笨最无用的工作 |
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g*****n
发帖数: 241 | 29 我的文章大体上是证明一个蛋白（A）down regulate另一个比较热门的tumor
suppressor (B)（之前没有报道过），先在线虫里面做，然后延伸到cancer cell line
里面也是一致。工作量不大，不是海量的数据。
总的来说就是线虫里面A的mutant里面见到B增加（western和immunostaining），然后B
的mutant可以suppress A的phenotype。还有过表达B也可以suppress由于过表达A造成
的相反的phenotype。在cancer cell line里面，过表达A的homolog，发现B的homolog
减少，siRNA knockdown A发现B增多。如果增加A上游的ligand，发现B显著减少，如果
knockdown A之后再增加同样的ligand就没有那么显著的效果。另外证明了A和B可以结
合，也narrow down了binding region （通过GST pull down，但不是co-IP）。还证明
了A可以磷酸化B （这里用的是人的homolog，因为线虫的A没有活性）。
基本结果就是这些了，A和... 阅读全帖 |
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k****l
发帖数: 279 | 30 在申请postdoc，暂时老板对我比较感兴趣。关于stipend，老板给了我两个选项
1.申请fellowship，我觉得这样可能更自由一点，但是fellowship带的经费都很少，大
家拿fellowhsip的买药品都怎么办？
2. 做一个小的leader，老板有一个NSF grant，要在一个模式生物里面建立 mutant
library (240, 000 mutants)， 然后送到一个中心保存。做这个我觉得实验经费肯定
有，然后手下有2-3个technician，自己有空的话可以做一些自己感兴趣的，就是怕
library 项目（大规模重复劳动）花时间太多，自己学到的东西比较少
本人希望postdoc期间每年能攒点钱，很多fellowship工资接近5万，是不是相当于加州
postdoc的平均工资？
多谢大家的意见 |
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y*****w
发帖数: 146 | 31 Thank you very much! Your instruction works.
Yes, I did not get the structure for the mutant. I am just curious what
the difference might be between the WT and mutant. |
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s******y
发帖数: 220 | 32 多谢指教！
其实我们最初的double mutant disease model 就是mixed 的， （主要是FVB/N）, 后
来又转了个C56BL/6的磷酸化基因。我的确发现在这个新的mixed的背景下，老鼠病的没
那么严重了，死的慢了不少，虽然还是有病。 更让我担心的是，的确有一部分老鼠，
好像都不怎么病，也不知道为什么 （比如 兄弟两老鼠，哥哥1个月就挂了，弟弟活了
一年多）。 不过在这样一个相似的大背景下，很明显triple mutant中有S_A mutation
heterozygous的死的更快。
所以我觉得很明显genetic background 有影响phenotype，但是并不至于dramatic到让
他消失，（只是让penetrance 或expressivity 变弱了）。
根据你第一段，我应该证明在一个pure的background 下，这老鼠有病，我们的model相
关的基因是重要的，
但是根据最后一段关于back cross的 理论，我要是把这老鼠们backcross了，性状可能
会变弱，或者丢失，我到底该怎么半呢？
如果出现了丢失的状况，是不是就证... 阅读全帖 |
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b******y
发帖数: 627 | 33 LZ wants a method that can monitor whether one conformation (active) is
preferentially stabilized versus others (inactive ones). No easy method,
though.
You might have to solve the structures of both wt and mutant and hope there
is difference. NMR is good at revealing conformational changes but your
protein might be too big for it. If you can design a good single molecular
FRET experiment, you might find more than one mode of conformations. In your
mutant, you see one of the conformation is more... 阅读全帖 |
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k******0
发帖数: 1073 | 34 Sunnyday， 谢谢你的指点。
你是否还有mutant actin的质粒，能否向你要些？
这些mutant actin在E coli中表达如何？ |
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D*a
发帖数: 6830 | 35 八卦一下，经常看见上来抱怨reviewer无理取闹的帖子。联想起来，听说做果蝇和线虫
的实验室之间都是相亲相爱，不抢别人的project （一个虫子大牛说的），要mutant就
给（一个果蝇小牛说得），不像老鼠people都很mean，要mutant不给，还抢别人的
project。
有没有人说说真是这样嘛？那你们投稿的时候reviewer也和蔼可亲嘛？提问都合情合理
吗？有毙了别人稿子自己scoop的现象发生嘛？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 36 哇靠，这个问题超过了我的专业范围，我只能大概就我知道的其他文章的例子
来建议一下吧。
要检测是否通过G protein, 无非就是这么几个思路：
1. G-protein specific inhibition: non-hydrolyzable GTP analog, GEF analog,
Knockdown of G-protein.
2. G protein dominant negative mutant
3. G protein dominant positive mutant
4. Or if you know something is in the middle of a pathway, you can also cut
off that middle player with methods similar as above. |
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p*****e
发帖数: 93 | 37 two isoforms for Gas; short one, GasQ213L; long one, GasQ227L. these are
constitutive active mutants. Dominant negative mutants, GasQ213L/D281N and
GasQ227L/D295N. you can buy from www.cDNA.org |
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g*****n
发帖数: 241 | 38 给你一些提示吧
1：看一下下面网页的life cycle，自己算一下从L1到adult需要多少时间，然后需要多
少时间从egg孵化到larvae
http://www.sfu.ca/biology/faculty/hutter/hutterlab/research/Cel
2：如果有normal head，那么应该epithelia没有影响。如果能够有后代，那么说明
muscle没有问题，reproductive tissue应该也没有问题。剩下两个你自己继续排除。
另外你可以到 www.wormbase.org 去查查 dpy mutant一般和哪些基因有关，这些基
因的功能分别是什么
3：在F1就分离到mutant，说明mutation is dominant。没有看到遗传到这个性状的后
代，说明很可能这个mutation同时也是 dominant sterile或者 dominant lethal。之
所以在F1能看到，多半是maternally rescued by P0
希望这些对你能有帮助 |
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m******5
发帖数: 1383 | 39 手上有一个mutant是新生死亡,如图，左边是mutant，右边是同一窝正常的鼠
从肤色上大家能得到什么信息？ |
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S*********s
发帖数: 304 | 40 恩，你还需要做的一件事就是确认那些posphorylation site是重要的，有功能的。
你需要做
knockdown, then rescue with S/T to A mutant and S/T to D/E mutant.
因为很多磷酸化位点虽然发生了，但是没功能。
你想象的想法很好，一不需要抗体，公司一般直接是把tagged kinase放在slide上
二。这个实验很dirty, kinase能磷酸化很多蛋白，特异性不够。
我说的是in vivo crosslink，用你的蛋白把kinase拉下来，但没有那么容易做。
我的感觉是，你需要多读一些kinase研究相关的paper.
Good luck. |
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l**********1
发帖数: 5204 | 41 next try gentleMACS™ Octo Dissociator
RUN four WT and four Mutant on the same dissociation/RNA extraction
then use Qiagen RNA mini kit
then compare WT and Mutant sample OD value
PDF link:
HTTPS//www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0002000/
IM0002018.ashx
18,600 usd/unit
or small type: gentleMACS™ Dissociator
HTTPS//www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001600/
IM0001677.ashx
5,700 usd/unit
or contact details:
HTTPS//www.miltenyibiotec.com/en/About-u... 阅读全帖 |
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g***n
发帖数: 14 | 42 谢谢你详细的回复
我的mutant实际上还有很多noise，原因是我的线虫体外回交成功率极低，这也是为什么
而且，我研究的线虫基因组还没有发表，所以也没有common variants数据库了，我这
个搞非模式生物的也只能流口水
所谓的wildtype A和B，是同一个isolate里发现的，理论上来说genome的variation很
小，测序数据也证明了这点
其中一个问题是，两个wildtype的差异基因很可能是控制上游表达的，而mutant中的
candidates基本都靠近下游。这是通过研究c elegans的ortholog 得出的结论。但不是
很肯定，因为线虫间的差异很大。
另外，我手上还有两个wildtype在stage L2的transcriptome，这个stage是所谓
phenotype的决定期。通过分析发现不到30个基因差异表达。有没有什么方法可以把
genome和transcriptome放在一起做个cross analysis的？
你上一个回复中提到的structure variation，是指rna的还是蛋白的？是怎么做呢？如
果有已经发表的文章，能不能给... 阅读全帖 |
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s********n
发帖数: 248 | 43 我想做cytokine bead array比较wildtype 和mutant 的mouse GM-CSF dendritic cell
的cytokine expression区别。之前的数据表明，mutant GM-CSF DC有增强的migration
，和antigen presentation。我还想比较一下cytokine secretion。
目前有BD的mouse inflammation kit，还有life technologies的luminex kit (10 and
20).大家谁用过他们的或者别家kit，能帮忙推荐一下吗？ |
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X******n
发帖数: 914 | 44 你的基因是个essential gene。 你买的这个是heterzygous deletion，很多时候这种
deletion没有表型。所以你应该先看看有没有你想要的表型，然后才做互补试验。
如果没有表型，你可以参考上面Tianzi的回复所说的方法，也可以去找找有没有ts
mutant。或者去看看Yeast DAmp Library 或者 TR Hughes 的 TetO7-promoter
mutants library有没有你想要的基因。 |
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e****s
发帖数: 1125 | 45 不知道是我没理解对，还是怎样。
根据你说的，D Mutant有表型，A Mutant没有，不恰恰表示Ser是一个重要的磷酸化位
点吗？D模拟该底物磷酸化以后的状态。
不知道所谓正常生理情况下不怎么重要的依据是什么？不知道Reviewer凭什么这样认为
的。 |
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S*********s
发帖数: 304 | 46 用过lenti/retro
感觉表达差不多，基本要2-3天。
lenti titer比较高 > retro.
两者包装的片段大小都有限，<80KD, 再大一点的蛋白对病毒滴度影响很大，一般需要
浓缩。
retro 较 lenti安全一些。包装retro的时候可以选择pCL-Eco, pCL-Ampho,etc等
不同的外壳蛋白。pCL-Eco只能介导感染mouse cell,在做oncongene的时候尤为重要。
你不希望用个EGFR mutant or K-Ras mutant的lentivirus 去感染你的小鼠or细胞，一
旦泄露，有oncogenesis的风险。
另外retro只感染分裂的细胞，生长很慢的细胞用retro感染效率很低。
另外从整合到基因组上的位点来看，lenti有 hotspot，retro更倾向于插入
transcription active的region。所以很多random mutagenesis是retro based的。
Adeno没用过，据说插入基因的size可以更大，但做载体比较麻烦,没经验。 |
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E******g
发帖数: 170 | 47 Cao E, Liao M, Cheng Y, Julius D (2013) TRPV1 structures in distinct
conformations reveal activation mechanisms. Nature 504:113-118.
Caterina MJ, Schumacher MA, Tominaga M, Rosen TA, Levine JD, Julius D (1997)
The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway.
Nature 389:816-24.
Caterina MJ, Julius D (2001) The vanilloid receptor: a molecular gateway to
the pain pathway. Annu Rev Neurosci 24:487-517
Cosens DJ, Manning A (1969) Abnormal electroretinogram from a Drosophila
m... 阅读全帖 |
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c*****8
发帖数: 49 | 48 找别的实验室要来的f/f小鼠，跟某种cre小鼠杂，得到的子代全部只有wt的条带，没有
mutant的条带，拿最早的要来的f/f小鼠做genotyping也是这个结果。给的protocol写
着wt应该有一条200
多的带，mutant会有100多的带，现在所有样品200多的带扩的很亮，100多的不管什么
样品都没扩出来过。已经优化了不少pcr条件了，但是还不行。我想一定是pcr有问题，
不可能对方给的全是wt啊。
大家有没有什么建议呢？先谢谢了！ |
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m*********D
发帖数: 1727 | 49 嘿嘿，准备赌一把。
我这个要mutate的基因是我要用的host cell生长必需的，是一个激素受体。mutant呢
，据说不需要激素也有活性了。所以，就想用没有激素的medium来筛选。希望wt的长不
出来或很慢。
另外，和老板谈了一下，理想状态是两个拷贝都mutate.但一个也能接受。我在想，要
是一个拷贝被knockout,一个被mutate也行。所以，strategy上，我想用两个guide
sequences.两个相距不远，大约是40 bp away。老板让我线赌一把，实在不行，就分两
步，先作stable cell line, 把mutant在这个细胞里表达，然后再来个CRISPR
knockout。
多谢你的指导和建议！这里真不错，都是同行，能相互学很多东西。 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 50 谢谢！刚找了一遍pUC18/19，都十多年没用过了，哪里找得到！还好，试验室好像有一
个自己作的cloning vector,估计是在pUC上多加了几个克隆酶位点，大小差不多（less
than 3kb)，应该可以用。
好，genomic region全sequence了，有两个SNP, 在intron region,也就是作HDR的ARMS
上，对整个设计没有影响。primers全送出去了，就等克隆一类。今天把几个要用的酶
买回来就可以过节了。
搞的这么复杂主要是想test我们自己筛选出来的compound。compound在WT上肯定每问题
，这些mutant是现有drug-resistant的病人里找出来的，所以，怀疑是drug-resistant
的机理之一。我要能建好一个细胞系，两个拷贝都突变的话，就把我们的compound往前
推进一大步。一个copy突变，一个不突变，该是病人的真实情况，但两个拷贝之间的表
达不清楚，所以，我要运气好，两个都变成mutant，那就太好了。 |
|
