m**c
发帖数: 90 | 1
No (I assume that the first line you mentioned is "private static myclass
instance = new myclass();"). The class loader will load your class before any
thread can access it.
Should "public myclass getInstance()" be "public static myclass getInstace()"?
If not, no one can create myclass since it only has private constructor.
In your case, probably not. Sometimes, people also use "Lazy Load" in their
singleton pattern, in that case, you may need to do it:
public myclass {
private static myc |
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x********q
发帖数: 108 | 2 可以这么理解，编译器是指上把这个方程编译成了类似
blahblah7myc8donothing9Ev（myc*)的C方程。
C++是静态语言，编译时就已经通过p的namespace,declared type/class和function
name找到了上述方
程，然后把p做参数压栈，call blahblah7myc8donothing9Ev而已。
所以，并非通过p找到了member function，而是通过p的类型找到的该方程。非virtual
function，每个类的object并不保存member function的地址。 |
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r****o
发帖数: 105 | 3 你给的信息不够，至少得说说这两个蛋白的标签是什么吧，比如
Flag, HA, 或者myc什么的。既然你用proteinA/G，你应该还加了一种
抗体可以把两个蛋白中的一个拽下来吧？
背景高倒是很常见，因为非特异性的结合会比较严重。要做得好，
被首先拽下来的蛋白的tag要比较好才行，而且如果用多次串联的TAG
会比较好，比如6XFLAG。也有人用两种不同的TAG串联在一起，通过
两步纯化来增强特异性。另外就是最好直接用抗体共价耦联的琼脂凝胶(
比较贵，1ML可能要五百多刀)。
还有就是，一般的做法是直接把洗过的beads 直接用sample buffer
煮。这样的样品非特异性的成分会不少，但如果用TAG peptide的溶液
冲洗蛋白(比如anti-flag matrix 用flag peptide 来冲洗)，效果会好很多。
没信号也许是因为缓冲液太强，或者是因为两个蛋白结合太弱，
冲洗过程中脱落了。用crosslinker可能会有所帮助。 |
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O******e
发帖数: 4845 | 4 ☆─────────────────────────────────────☆
ihavenothing (smallpotato) 于 (Fri Dec 15 16:47:35 2006) 提到:
同学们，请看这篇文章
Nature 435, 839-843 (9 June 2005)
c-Myc-regulated microRNAs modulate E2F1 expression
Kathryn A. O'Donnell1,2, Erik A. Wentzel2, Karen I. Zeller3, Chi V. Dang1,2,
3,5 and Joshua T. Mendell1,2,4
http://www.lib.ncsu.edu:2118/nature/journal/v435/n7043/full/nature03677.html
在Figure4a, 如果我没有理解错的话，这是要to determine whether E2F1 is a
target of miR-17-5p and miR-20a. 如果我没有理解错的话，正确的做法是，将E2F1
的 |
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p*3
发帖数: 45 | 5 "这里面包括Arnold Levine的p53, Wen-Hwa Lee的Rb, David Baltimore的
NF-kappaB, Gerard Evan的Myc, Pierre Chambon和Ron Evans的nuclear hormone
receptor superfamily 等等，" |
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c*********r
发帖数: 1312 | 7 wiki了一下，“Myc is activated upon various mitogenic signals such as Wnt,
Shh and EGF (via the MAPK/ERK pathway).”看来Wnt比较上游。在胚胎发育里也是。
可能太上游的信号通路不会“直接”诱导细胞。。。（也许长期来看有可能？也许还更
多能一些？？） |
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w******y
发帖数: 8040 | 8 很多也是癌变过程的重要驱动因素
比如EGFR amplification in NSCLC, N-myc amplification in NB etc |
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l*********k
发帖数: 16 | 9 TRAIL and RAc target the APC-β-catenin-c-Myc signaling pathway for
apoptosis in APC-deficient cells (Nature 464, 1058-1063
Bzozi! |
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c******s
发帖数: 428 | 10 Featured ArticleFree
c-Myc Regulates Transcriptional Pause Release p432
Peter B. Rahl, Charles Y. Lin, Amy C. Seila, Ryan A. Flynn, Scott
McCuine, Christopher B. Burge, Phillip A. Sharp, Richard A. Young
Summary | Full Text
Crystal Structure of the Caenorhabditis elegans Apoptosome Reveals an
Octameric Assembly of CED-4 p446
Shiqian Qi, Yuxuan Pang, Qi Hu, Qun Liu, Hua Li, Yulian Zhou, Tianxi He,
Qionglin Liang, Yexing Liu, Xiaoqiu Yuan, Guoan Luo, Huilin Li, Jiawei Wang
, Nieng Yan, |
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M******g
发帖数: 152 | 11 hi, friends:
I need to use a phosphoserine antibody to detect a receptor (Dopamine D1
receptor) phosphorylation. I know phosphoserine antibody from many
companies are quite lousy. Can you recommend a good one based on your own
experience? Thanks.
MYC |
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h******u
发帖数: 602 | 12 确实这篇CELL里面的CHIP-CHIP真是没啥，好多年前有人做过了，没啥新颖的。不过他们
提出了 C-MYC能抑制transcription pausing，这好像比较感兴趣。 |
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e******x
发帖数: 9 | 13 看到这里有很多牛人都做过CHIP试验。 想请教一下大家：
（1）一般做完IP以后大家是怎么purify pulled-down chromatin DNA的？ 我看到网上
说可以
用PCR purification Kit 直接纯化，请问这里有人试过吗？
（2） 我最近才开始摸索条件，上一次实践结果，一个sonicated lysate sample 还可
以， 但另
外一个IgG control 有阳性。请问可能什么地方出现问题了呢？
（3）大家有什么好的protocol可以推荐一下啊？我只是需要做一个简单的Myc-tag的
CHIP. 抓下来
Chromatin DNA 看看几个结合位点再两个条件下有没有变化。最后的结果想用Real-
time做。上次
买了一个Active Motif 的CHIP Kit. 但发现最后的elute buffer 好像和我的SYBR Mix
不兼
容，严重影响PCR反应 （必须稀释20倍以上）。
望高人指点， 万分感谢！！！！ |
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p*****p
发帖数: 61 | 14 自己网上看了些论坛和文章，选了几个：
Rabbit anti-HA : Sigma - Product number H6908
Mouse anti-HA : Covance - Product number MMS-101R (HA.11)
Rabbit anti-cMyc : Sigma - Product number C3956
Mouse anti-cMyc : Sigma - Product number M5546
Mouse anti-Flag : Sigma - Product number F3165 (M2)
最后一个感觉比较有把握，其它没有什么把握。有用过的能推荐下吗？
谢谢！ |
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m******5
发帖数: 1383 | 16 在着手要构建一只CHIP用的转基因鼠
现在有三种标签选择
Myc
FLAG
ZZ
个人有点倾向于用ZZ标签，因为能直接亲和protein A
不知版面上是否有大佬有这方面经验的能否指点1，2，转基因鼠周期都很长，所以不敢贸然决定 |
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M*****e
发帖数: 279 | 17 Baltimore does not have that many papers with >1K citations (Web of Science).
Citations of David Baltimore
1. Title: An essential role for NF-kappa B in preventing TNF-alpha-induced
cell death
Author(s): Beg, AA; Baltimore, D
Source: SCIENCE Volume: 274 Issue: 5288 Pages: 782-784 Published:
NOV 1 1996
Times Cited: 2,067
2. Title: A NEW DNA-BINDING AND DIMERIZATION MOTIF IN IMMUNOGLOBULIN
ENHANCER BINDING, DAUGHTERLESS, MYOD, AND MYC PROTEINS
Author(s): MURRE, C; MCCAW, PS; BALTIMORE |
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d********e
发帖数: 321 | 18 myc tag is so small, and I think it's hard to see it on WB.
I didn't do isotype control, maybe I should. thanks for all the suggestions. |
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d********e
发帖数: 321 | 19 that makes sense. I was thinking of probing myc after WB for B on the same
membrane. |
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d****u
发帖数: 1553 | 20 其实最好的control应该是在负对照里加一个有myc tag的蛋白比如GFP啊啥的。最好要
和你的sample是相同的质粒只不过蛋白不同，然后做IP。保证能封住所有reviewer的嘴 |
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W****C
发帖数: 1937 | 21 可以不用同位素标记吗？ 合成的蛋白量用抗体能测到吗？ 比如是比较常规的FLAG 或
MYC抗体 |
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w********r
发帖数: 1431 | 22 K从25-175mM，
Mg从0.5-2.5mM，要自己试。
test用5ul做反应就可以，HA,M2,Myc WB都可以看到。
我还加了点RNase Out,这些反应的优化条件网上有，你可以去找找。 |
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i*****i
发帖数: 30 | 23 这里有几个概念：
1. in vitro expression: myc-tagged protein-A IP Flag-tagged protein-B 这是普
通IP过程。
2，如果分开表达的WHOLE CELL LYSIS做IP，那说明这2个蛋白相互作用更加直接(对上
下游信号要求不严格)，很可能是一级结构结合。
反之，就是需要正确折叠或者磷酸化修饰等二级三级结构。
3. 一起转染表达的话，根据表达量来决定IP需要的WCL ug数.最常见IP：400-500ug
WCL加1ug抗体。 |
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d*******w
发帖数: 45 | 24 上次大家在讨论抗体的时候（具体忘了哪个帖子），有提到过某个大学的抗体中心会卖
一些常见的抗体相当便宜，谁能帮忙给个连接？ 或者有哪些公司会卖比较少量的像
40ug这中大小的？
另外想问一个关于c-myc抗体的问题，我用的是Cell Signaling 的抗兔抗体。做WB的时
候后用1：1000，但是从来没出现过。我的cell lysates 是直接将SDS上样buffer加到
细胞里，煮10分钟后，离心，上样。不知道有没有人和我出现同样的问题？或者我有哪
里做的不对？谢谢指教 |
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Z******5
发帖数: 435 | 25 我也在用c-MYC的抗体，用了两家公司的，杂带都很多。 abcam的还勉强可以用。 |
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Z******5
发帖数: 435 | 26 c-Myc内源性的很难检测，信号很弱，HepG2，A549的都是这样。检测knockdown的效果
感觉就是在YY。 不过转入pcDNA3.1过表达的，信号非常非常非常（n个非常）强。 |
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S*******m
发帖数: 34 | 27 有一些蛋白在正常组织里边就是这样的.正常情况下表达很低.只有在某些情况或某些组
织里面才高表达.
参考p53,c-Myc,progesterone receptor. |
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i*********0
发帖数: 915 | 28 cell signaling 今天告诉我,他们不再供应了.
各位老大能不能提供一个其他公司的antibody!
谢了先. |
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r***e
发帖数: 2539 | 29 oncogene addiction?
一些癌细胞依赖某个oncogene，去掉后不能生长，比如Ras, myc。 |
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p******i
发帖数: 1092 | 30 计划做一个protein的tetramer，然后用tetramer做binding.
思路是：
1) express protein from 293T supernatant，purify by HIS column
2）in vitro biotinylation by BirA biotin ligase (site-specific)
3) add streptavidin-PE to make TETRAMER
请问大家觉得我这个思路可以吗？
哪位做过TETRAMER的，还请不吝赐教啊～～～多谢了～～～
另外，能请各位看看下面的内容给提点意见吗？因为克隆测过序没问题，但是现在还没
看到secretion的表达 = =
在protein的N端加上：
kozak-preprotrypsin signal peptide（for secretion，貌似这样产量会高一些，而
且可能提纯好做一些）, AviTag peptide (AviTag 是BirA ligase的识别site，可以用
来做site specific的biotinylation)
preprotrypsin ... 阅读全帖 |
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y**********o
发帖数: 37 | 31 前面有人提到了你用的两个酶切位点在载体上只隔了一个碱基,这种情况下载体双酶切
效率是很低的.
另外不知道你想加什么Tag到你要表达的蛋白上?如果是常见的FLAG和Myc这些,可以用个
笨点的方法,clontech有很多带Tag的表达载体,先把cDNA插到这些载体上,然后再用另一
对引物PCR扩带有Tag的蛋白序列.如此一来就避开了你的引物过长这个问题.并且只需要
做最常规最简单的克隆,只是在载体和酶切位点的选择上需要多花点时间验证. |
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c****l
发帖数: 1086 | 32 你如果实在讨论在体外的transformation的话，那就是和体内的概念完全不同了。
只有一个oncogene而且还是wt，（也就是还不能称oncogene只是proto-oncogene，），
即使是真正的所谓oncogene（mutated one）经典的象myc,ras，E1A on its own也无法
transform cellline，原因很明显，scott lowe，John Cleveland十多年前就发现了，
单独的oncogene acitvation会induce cell death。 必须要结合inactivation of P53
or Arf ...才可能transform cell。你所指的cellline往往都是immortalized，而
immortalized celllines 30% has p53 mutation, 30% has Arf mutation, another
30% has mdm2 amplification。
你要是真要找一符合你的标准的wt的“oncogene”，那我就告诉你一个吧。
SV40， 哈哈哈哈哈哈哈... 阅读全帖 |
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Z******5
发帖数: 435 | 33 看抗体说明书，告诉你哪个位置的是就是了。
很多蛋白翻译后有修饰的，分子量会差很多。比如c-Myc，氨基酸分子量是48kD，但是
表观分子量是64kD或者68kD（不同抗体说的大小不一样，但应该是同一个条带） |
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n****n
发帖数: 434 | 34 There are a couple of things you may need to know (assuming the gene is
indeed the correct TS gene):
1. A TS gene may not inhibit cell growth when overexpressed. This is because
the TS gene product may need to be activated. If your cells are not
challenged with the right condition, they may not respond to the TS. If the
TS gene product is analogous to some kinases, phosphatases, receptors, you
may be able to construct a constitutively active mutant and then use this
instead. If you suspect your... 阅读全帖 |
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h********n
发帖数: 4079 | 35 各位回帖说得真好啊. 我也乱说一些我的做法.
1. what is the promoter? if you know the promoter, you can guess whether it
is a tissue specific gene.
2. what cell type in pancreas express this gene, epithelial or other?
immuno staining should answer this question.
3. select cell lines based on answer to question 1 and 2
4. take highly malignant cancer cell lines, overexpress this gene by
transient transfection, cell viability assay, tumorigenecity (in vitro and
in vivo) assay and invasion assay should be used. Growth... 阅读全帖 |
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Z******5
发帖数: 435 | 36 搭车问问：
话说我最近overexpress c-Myc，MTT也检测到细胞增殖变慢。 这个不应该啊。
补充一句，我的质粒表达能力非常强，估计是细胞凋亡导致的？ |
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S******e
发帖数: 393 | 37 希望特异性好，没有杂带，
第一次在这儿发帖问问题，谢谢各位！ |
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S******e
发帖数: 393 | 39 多谢！ 请问哪家公司的比较好？
钱不多，所以买东西比较小心。 |
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d****u
发帖数: 1553 | 40 试试sigma的吧，不知道你这个要求有多高，不过我用过几家不同公司的，差别也不算
巨大。 |
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i*****r
发帖数: 65 | 41 学生物的你伤不起zz 应个景（转）~~~
高考之前流传一句话“二十一世纪是生物的世纪”从此就跳进火坑了有没有！！！！！
考得比谁都高学得比谁都苦考了笔试考实验最后收入比谁都低！！！有没有！！！！！
一进大学就开始狂背这辈子除了考试就用不到的东西有没有！！！！
鸟适应飞行的进化十大特征！ 三碳循环！二十个氨基酸中文名！！！！！
英文名！化学式！化学结构！性质特征！
最变态的还有代谢途径 ！！！！！
氨基酸有多少种代谢途径有没有！
背什么生糖氨基酸 生酮氨基酸 生糖兼生酮氨基酸！！！！
你以为生完酮就完了？根本没完！还有分解转化！
转成糖有没有！转成脂肪有没有！
不要以为吃了蛋白质不吃脂肪就不会长胖有没有！蛋白质可以转化为脂肪的！
你以为把氨基酸代谢背完了就完啥了！没完！！！！！！
还有糖代谢！糖氧化！糖酵解！脂肪代谢！脂肪酸代谢！核酸代谢！有没有！
DNA完了RNA RNA完了rRNA, rRNA完了mRNA，然后RNAi！！！！！
你有完没完了！！！
原核遗传学完，还有真核遗传！
这还只是一门课有没有！！！！！
你说学生物的人不正常！背下来这么多没用的东西还能正常么！！！！
学GRE的... 阅读全帖 |
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a********k
发帖数: 2273 | 42 花了一个小时，深深的鄙视一下自己的无聊行径！！
125 蔡亮 男 1980年11月 复旦大学 生命
科学 2007年12月毕业于[美国]北卡大学 [美国]加州大学旧金山分校 博士后
Cai L, Mostov K. Polarity is destiny. Cell. 2009 Nov 13;139(4):660-2. PubMed
PMID: 19914162; PubMed Central PMCID: PMC2900917.
Cai L, Makhov AM, Schafer DA, Bear JE. Coronin 1B antagonizes cortactin and
remodels Arp2/3-containing actin branches in lamellipodia. Cell. 2008 Sep
5;134(5):828-42. PubMed PMID: 18775315; PubMed Central PMCID: PMC2570342.
Cai L, Makhov AM, Bear JE. F-actin... 阅读全帖 |
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n***g
发帖数: 5027 | 44 病毒： retrovirus，很巧妙，在体细胞中表达，ES中silence。
当然最主要的巧指的是他的liberary， 一般人如果能想到，最多也就能想到的也就是
Oct4, Sox2, Nanog 这些ES marker， yamanaka加入了很多oncogene，后来发现klf4也
是必须的，c-myc能大大提高效率。
你可以试着举几个比yamanaka更高明的设计出来瞧瞧。
deserve |
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s******r
发帖数: 2876 | 45 我觉得你没有仔细看他的paper，他那20基因不是随便挑的，个个都是已知和stemness有
关的，如果只用OCT4,SOX2,Nanog他也会成功，KLF4也不是必需的，只是提高了效率。
说得还是他的大胆，这么一锅粥煮在一起，竟然成了。
病毒： retrovirus，很巧妙，在体细胞中表达，ES中silence。
当然最主要的巧指的是他的liberary， 一般人如果能想到，最多也就能想到的也就是
Oct4, Sox2, Nanog 这些ES marker， yamanaka加入了很多oncogene，后来发现klf4也
是必须的，c-myc能大大提高效率。
你可以试着举几个比yamanaka更高明的设计出来瞧瞧。
deserve |
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c**********8
发帖数: 458 | 47 近日中科院上海药物研究所/国家新药筛选中心的研究人员在小分子化合物提高iPS诱导
效率的研究中取得突破性研究成果，相关研究论文发表在重要核心期刊《Cell
Research 》上
《Cell Research》杂志于1990年创刊，2001年首次获得影响因子，创造了中国人创办
与出版的科技期刊首次突破2分的历史纪录。份杂志由中国科学院上海生命科学研究院
生物化学与细胞生物学研究所与中国细胞生物学学会共同主办，2006年与国际著名的自
然出版集团合作，通过优秀论文开辟快速审理的绿色通道，国际编委协助组织专题稿件
，期刊发表的优秀原创论文推荐到顶级学术期刊点评栏目等。并且在之后的这些年里，
影响因子逐步提升，今年其影响因子达增长至9.417，位于国际细胞生物学领域核心期
刊10%。
文章的通讯作者是中科院上海药物研究所/国家新药筛选中心的白人计划女博士谢欣，
本研究工作得到中科院干细胞先导专项及科技部重科学研究计划的支持。
干细胞具有在体外大量增殖和分化为细胞的潜能，可为再生医学的替代疗法提供充足的
细胞来源。2006年以来，日美科学家利用病毒载体转染不同转录因子（Oct4, So... 阅读全帖 |
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g***s
发帖数: 30 | 48 我们在验证两个蛋白A和B的相互作用，一开始我们用HA-A 和MYC-B 一起过表达，然后
Co-IP，做了好几次，只有一次能看到很弱的条带，一筹莫展。
最近，抱着试试的态度，只在细胞中过表达HA-A，然后Co-IP内源性的B，结果却相当理
想。
虽然获得了想要的结果，但是为什么会这样呢？ B蛋白内源性的能Co-IP，为什么过表
达却拉不下来了呢？ 大家能解释为什么吗 |
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w***a
发帖数: 133 | 49 hepg2就是随便养养都不会死的
原代细胞要养也不困难 就是体力活
不能用普通的加血清medium 要配一打东西混合的cocktail来养
如果不用类似于myc之类的东西让他永生，他是只会死不会分裂的 |
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v**********9
发帖数: 846 | 50 曾经买过sigma的，但是不好。请大家推荐一个好用的吧。 |
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