i*********0
发帖数: 915 | 1 我做的gene (A)在胚胎早期deletion导致lethal phenotype,我想看看在胚胎发育中期
或者晚期 (从15.5开始)deletion, A
gene 对发育的影响. 我的一个line的老鼠是A gene flox/flox, ER-cre+ 的,我想用
OHT 或者4-OHT 在E15.5的时候诱导
A gene deletion, 目前考虑两种方法:一是做ip注射好,二是是通过drinking water.
我只看过一些在成体做Ip 的paper,但是
用的volume都比较大,我也不想给怀孕老鼠更多的stress. drinking water倒是没有伤
害,但是我担心deletion的效率不高.
不知道那位有更好的办法,或者comment一下我列举的.
谢谢! |
|
发帖数: 1 | 2 I ask for paper, due to unavailability of downloading in our hospital.
J Heart Lung Transplant. 2016 May 6. pii: S1053-2498(16)30110-3. doi: 10.
1016/j.healun.2016.04.007. [Epub ahead of print]
The effect of timing and graft dysfunction on survival and cardiac allograft
vasculopathy in antibody-mediated rejection.
Clerkin KJ1, Restaino SW1, Zorn E2, Vasilescu ER3, Marboe CC3, Mancini DM4.
Author information
Abstract
BACKGROUND:
Antibody-mediated rejection (AMR) has been associated with increased... 阅读全帖 |
|
l******n
发帖数: 298 | 3 请教sunnyday,你是用OHT做老鼠试验吗？那么我有一个问题，假设平滑肌细胞的ER老鼠
给了OHT以后诱导蛋白表达，那么停药以后新分化的细胞还会表达这个蛋白吗？我看有
的人一直给OHT,有的人给几天就完事了。
第二个问题请教的就是OHT的剂量你是怎么控制的。
谢谢哦 |
|
l******n
发帖数: 298 | 4 看来玩tamoxifen的战友还不少啊。
dua说的对，我也想先看看效率。打了5天，好像没啥效果！想用OHT主要是看richard
lee还有几个大牛发好文章都用OHT,我就想人家也不傻干嘛非用OHT啊。
dua你打OHT一般几天见效果重组？ |
|
C***2
发帖数: 62 | 5 Hey, i have aseveral questions to ask for help.
I want to knockin CreERT2 to specific locus, southern blotting suggested
that the ES clones are targeted correctly. But i am not sure if the CreERT2
is functional or not, therefore, i want to detect the function in vitro ES
based assay. My designed experiments is:
1) Electro-transfection of loxp-CMV Driven GFP-loxp plasmid to ES, the
transfected ES cells are split to 2 dish, one dish is treated with 4-OH,
another dish is conrol.
2) Prepare lentivir... 阅读全帖 |
|
l******n
发帖数: 298 | 6 谢谢sunnyday。
有两个基本的问题
Supposing it is Cre-ER recombination with ROSA-b-gal，after giving OHT,
tissue will be X-gal positive. For those cells showing blue positive
staining, after proliferation and dividing, will their daughter cells also
express X-gal? That said, is that a permanent recombination?
Secondly, supposing a certain percentage of bone marrow cells will
differentiate into new tissues, the differentiation was induced after OHT.
Do you think the newly differentiated tissue will be recombin... 阅读全帖 |
|
i*********0
发帖数: 915 | 7 最近做一个实验，用E14.5和E13.5时期isolated 的MEF （primary）来做实验，我发现
用4-OHT做gene inducible deletion5天，然后wash out 4-OHT以后，E14.5的mutant
细胞相对E14.5的control cell line proliferation降低，但是E13,5 的mutant cell
相对control cell line的proliferation居然升高了 （我每个时期的细胞系都有2个
control 2个mutant），一头雾水呀。 |
|
i*********0
发帖数: 915 | 8 谢谢回复呀。
我一般都是seed 1x10^5 cells/6 well. 细胞生长的也不是很dense，而且我重复了一
次，结果是一样的。搞得结果很难解释。我现在就是想是不是这个OHT对我的细胞有影
响，还是我研究的这个gene 对 OHT treatment 有response。
其实这个gene我们propose和stem cell 的分裂和分化有关，一个naive的想法就是E13.
5的primary细胞是不是保留了更多的stem cell identity？ |
|
l******n
发帖数: 298 | 9 高手，谢谢哦。你说对了，我这个ER表达很低。不过我这个不是cre-ER system的KO.我
这个是knockin一个human transgene on top of endogenous gene, to check the
ectopic overexpress of the protein.我老板说ER正常情况下抑制这个蛋白，一旦加
了OHT,蛋白就活了，我不太懂原理，就是跟着做了。
这种情况tam or OHT有区别吗？
blame |
|
h********n
发帖数: 4079 | 10 其实我是急着加 4-OHT, 又怕影响lentivirus的感染.
4-OHT会影响lentivirus的效率吗? |
|
h********n
发帖数: 4079 | 11 其实我是急着加 4-OHT, 又怕影响lentivirus的感染.
4-OHT会影响lentivirus的效率吗? |
|
|
R*I
发帖数: 1840 | 13 世界半潜船市场概况
目前世界上主要有四家公司经营半潜船业务，处于寡头垄断状态。除了中远航运外，另
外三家是荷兰道克维斯（DOCKWISE）航运公司、挪威OCEAN HEAVYLIFT(OHT)公司和荷兰
FAIRSTAR公司。 荷兰DOCKWISE公司成立于1994年，是目前世界最大的多用途海洋
重型运输公司，有各类半潜船共计22艘，载重吨合计78.3万吨。其中5艘为运送游艇专
用，6艘为改装油轮（T系列），9艘为开放式甲板，平均船龄为22年。其中船龄超过20
年的有19艘，多数将在10年内退役。2006年12月23日，Heerema（76%）和WW（24%）把
其持有的Dockwise股权全部出售给全球著名的私募基金管理公司3i，成交价格超过7亿
美金。3i决定Dockwise当时的管理团队继续管理公司。
此外，还有一个特殊的竞争对手是中国振华港机集团。1998年以前，荷兰DOCKWISE公司
的半潜船，垄断了全球港口机械远洋运输。振华港机建造的港口机械均要花费巨额资金
租用其船舶运至欧美。既贵又不准时，还屡屡加价。逼得振华港机一口气建设了22艘六
万吨级整机运输船，将荷兰DOC... 阅读全帖 |
|
l****p
发帖数: 135 | 14 mark
世界半潜船市场概况
目前世界上主要有四家公司经营半潜船业务，处于寡头垄断状态。除了中远航运外，另
外三家是荷兰道克维斯（DOCKWISE）航运公司、挪威OCEAN HEAVYLIFT(OHT)公司和荷兰
FAIRSTAR公司。 荷兰DOCKWISE公司成立于1994年，是目前世界最大的多用途海洋
重型运输公司，有各类半潜船共计22艘，载重吨合计78.3万吨。其中5艘为运送游艇专
…… |
|
w***n
发帖数: 2474 | 15 还记得吗，今年8月在新加坡附近海域，美军“麦凯恩”号被商船撞出一个大洞。近日
，这艘军舰终于贴上“创可贴”，被中国造半潜船“公主抱”回驻日美军基地疗伤了。
美国海军日前发布了“约翰•麦凯恩”号驱逐舰（DDG 56）在新加坡樟宜海军基
地完成装船作业后由半潜船运往日本横须贺的图片，从图中可以看到，“约翰•
麦凯恩”号被斜着固定在半潜船的装货甲板上，并被完全托出海面。
照片已经公布几日了，但很多人不知道的是，“抱”它的半潜船，是妥妥的中国造。
据美国海军第七舰队官方“脸书”消息，负责运载受伤的“麦凯恩”的这艘半潜船名为
“财富”号（MV Treasure），观察者网注意到，该船承建者为中远海运重工旗下的舟
山中远船务，于2008年交付世界著名的荷兰DOCKWISE航运公司。
“财富”号由油轮改装而来，载重量为3.5万吨，托起0.9万吨的“麦凯恩”娇躯，
并不费力。
为了顺利完成转运工作，美国海军海洋工程主管及潜水救捞监督部派出的相关领域专家
制定了“约翰•麦凯恩”号驱逐舰的转运工作相关流程，首先就是为“约翰&#
8226;麦凯恩”号设计和安装一个临时船体... 阅读全帖 |
|
G********e
发帖数: 528 | 16 不会
TAM就可以，如果对老鼠
cell culture的话用OHT |
|
i*********0
发帖数: 915 | 17 tamoxifen
这个东西可以在体内被代谢一下，变成4-oht吧。 |
|
h******y
发帖数: 1374 | 18 麻烦问问4-Hydroxytamoxifen（4－OHT）粉末应该融在95%的EtOH还是别的什么呀？
多谢！ |
|
l******n
发帖数: 298 | 19 谢谢，我觉得第一个问题你回答的很好，第二个问题，可能我没说明白，我的意思是说
先OHT给药，然后停药以后给骨髓bone marrow mononuclear cells. 新分化的组织如心
脏或血管不应该再有b-gal，因为这部分从骨髓或周边血来源的分化的组织在给药的时候还没有smooth muscle promoter的活性。
所以我觉得新分化的组织，从骨髓来源的，或者是Bone marrow mononuclear cells来源的，不应该再有蓝色的X-gal阳性显色。 |
|
|
D*a
发帖数: 6830 | 21 今天刚问了，OHT是tam肝脏代谢后的产物，也是真正有毒性和产生KO的分子。
我们实验室里他们用的是普通的tam，打成年鼠。 |
|
l******n
发帖数: 298 | 22 多谢你。是的，tam代谢以后成为有活性的4-OHT.我再鼓捣鼓捣。刚开始用这个ER老鼠
，还不太熟悉。 |
|
j******i
发帖数: 939 | 23 5个小时足够lentivirus进入细胞了 一般半个小时就可以看到virus进入细胞了 不确定
最快多久能整合到基因组里 lentivirus还有个reverse transcription的过程 如果4-
OHT不是逆转录抑制剂的话 5个小时没有问题 你有lv-gfp做control的话 可以知道到底
有没有影响转录和插入了 |
|
j******i
发帖数: 939 | 24 5个小时足够lentivirus进入细胞了 一般半个小时就可以看到virus进入细胞了 不确定
最快多久能整合到基因组里 lentivirus还有个reverse transcription的过程 如果4-
OHT不是逆转录抑制剂的话 5个小时没有问题 你有lv-gfp做control的话 可以知道到底
有没有影响转录和插入了 |
|
i*********0
发帖数: 915 | 25 我想验证一下一个gene的KO能不能提高ips generation的效率，已有可以用OHT 做
induced deletion的MEFs，想问一下一个周期的ips generation一般多长？
谢谢！ |
|
i*********0
发帖数: 915 | 26 我想验证一下一个gene的KO能不能提高ips generation的效率，已有可以用OHT 做
induced deletion的MEFs，想问一下一个周期的ips generation一般多长？
谢谢！ |
|
Z******5
发帖数: 435 | 27 背景：我们前期发现gene A在肿瘤发生发展过程中会异常定位到细胞核中，但是具体入
核机制现在还没搞清楚。目前重点还在研究gene A入核后的功能及该功能的机制。
现在想做一个乳腺组织特异的gene A诱导入核的小鼠模型。初步设想是用ER融合gene A
， 通过4-OHT诱导入核，然后观察表型。
我们用的是ER的288-599AAs的，其中G525R做了突变，具体参考文献是 A modified
oestrogen receptor ligand-binding domain as an improved switch for the
regulation of heterologous proteins （http://nar.oxfordjournals.org/content/23/10/1686.short)。
问题是：1.我们是否要单独做一个不包含gene A，该ER片段的对照小鼠？ 虽然该文献
报到ER288-599(G525)是no TAF-2 transactivation activity， 但是毕竟ER是一个和
乳腺癌密切相关的分子，而且我们用了将近整个ER的一半... 阅读全帖 |
|
