l**********1
发帖数: 5204 | 1 OMG
LZ used degenerated primer for cDNA single strand synthesis
R U Seriously? an amateur molecular biologist LZ?
Please go to
//www.protocol-
online.org/prot/Molecular_Biology/RNA/Reverse_Transcription__RT____cDNA_Synthesis/index.html
RT reaction is also called first strand cDNA synthesis. Three types of primers can be used for RT reaction:
oligo (dT) primers, random (hexamer) primers and gene specific primers with each having its pros and cons.
or
/media.affymetrix.com/support/technical/usb... 阅读全帖 |
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c*******e
发帖数: 30 | 2 【 以下文字转载自 Chemistry 讨论区 】
发信人: cafelatte (小雕), 信区: Chemistry
标 题: 向高人求救：请问实验室测定polymer，oligomer的方法。
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Sep 24 19:32:53 2006)
rt，谢谢，根本没有化学背景，可是现在却要搞有关这方面的研究，望这方面的大牛指
导一下。同时有什么好的参考书或者网站推荐学习。万分感谢！ |
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s****e
发帖数: 2934 | 3 ☆─────────────────────────────────────☆
cafelatte (小雕) 于 (Sun Sep 24 19:34:01 2006) 提到:
发信人: cafelatte (小雕), 信区: Chemistry
标 题: 向高人求救：请问实验室测定polymer，oligomer的方法。
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Sep 24 19:32:53 2006)
rt，谢谢，根本没有化学背景，可是现在却要搞有关这方面的研究，望这方面的大牛指
导一下。同时有什么好的参考书或者网站推荐学习。万分感谢！ |
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p****s
发帖数: 3153 | 4 我觉得oligomer的问题是很难定义一个在生理上重要的，并且"on pathway" oligomer
，如果不是
in vivo，我觉得研究意义都一般...PrPc那个...没看过那篇文章，不过看了后续
Nature上的讨
论，觉得争议还是很大的说。不过本来alzheimer这领域争议就够多了，也无所谓了哈
哈。我是不相信
oligomer这种东西能有什么receptor，我还是更倾向物理上的破坏什么的。
p.s. 我不是insider，哈哈
hypothesis. I
receptor.
PrPc. |
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e****s
发帖数: 1125 | 5 高浓度形成inactive 的oligomers?
可以跑个Gel filtration看看，如果有Oligomers形成，分别收集Oligomers和Monomer
，测活。 |
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x*****g
发帖数: 82 | 6 谁有时间申完一篇稿子，明天就是deadline了，我忘了拒绝，领域不是特别熟悉。有人
熟悉这个领域，可以给我发信，我给你转过去。
A series of ladder-type graphene ribbon oligomers have been synthesized
through DDQ/acid-mediated oxidative cyclizations. The oligomers
present a bright blue light emission, and the new oligomers were clearly
characterized by NMR and MALDI-TOF。 |
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l**********t
发帖数: 5754 | 7 http://www.pnas.org/content/81/8/2421.long
Abstract:
"
Analysis of the published base sequence residing in the
pOAD2 plasmid of Flavobacterium Sp. K172 indicated that the
392-amino acid-residue-long bacterial enzyme 6-aminohexanoic
acid linear oligomer hydrolase involved in degradation of
nylon oligomers is specified by an alternative open reading
frame of the **PRE-EXISTED** coding sequence that originally specified
a 472-residue-long arginine-rich protein.
" |
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b****n
发帖数: 311 | 8 怎么没人提Abeta oligomer hypothesis? 看上去挺make sense,有没有内行点评一下？
还有strittmatter lab去年的Nature和今年的J Neuroscience，说PrP-c是Abeta
oligomer receptor,大家有什么看法？ |
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s******9
发帖数: 283 | 9 着急寻找三种protein complexes，hetero-oligomer或者homo-oligomer无所谓，
protein最好要小，能在E.coli体系表达。希望三个complexes Kd值分别在pM，nM和uM
的级别。 |
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h*******o
发帖数: 4884 | 10 1) due to the intrinsic difference between rodent Abeta and human Abeta,
rodent Abeta do not form aggregates easily as human abeta.
For more detailed info, check "Charles G. Glabe" or Frank Laferla's paper.
As for NFT, most people in the field now agree that Tau is downstream of
Abeta.
2) Calcium and neurocytotoxicity hypothesis is quite old. It definitely has
its points but not the whole scheme.
3) Abeta is solube. The problem is Abeta oligomer. And the current opinion
is that soluble Abeta ol... 阅读全帖 |
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e****s
发帖数: 1125 | 11 Just a guess,
Is it possible:
These peptides are dimers or oligomers at high concentration, which can't
bind the targeted protein. At low concentration, the oligomers dissociate to
monomer, which can bind. |
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i***l
发帖数: 1656 | 12 agree with above,maybe oligomer due to non specific hydrophobic interactions
, which is not uncommon among transmembrane proteins.
4-6M urea, try to completely denature your sample,
however, if oligomer forms, sample usually runs in a ladder pattern, say,
dimer, tetramer, etc. if you only see two major bands, one monomer, the
other ~4x or 6x apparent molecular weight, it's still a little weird to me. |
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p*******n
发帖数: 445 | 13 Robinson那篇似乎也有Pandis参与吧，Pandis之前就提到过POA是semi-volatile并可以
形成SOA的
做oligomer的意义毕竟还是有的，尤其是像一些biogenic的precusor，形成oligomer可
以解释比预测值要高的soa yield，再加上庞大的source，我觉得重要性不比这个小。
04年Jang不就是靠提出这个发了science了么。 |
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r******s
发帖数: 3662 | 14 【 以下文字转载自 WBCenter 讨论区 】
发信人: mitbbscheck (一夫当关万夫莫开), 信区: WBCenter
标 题: Re: NCAA版 rayfalls 申请代发200包子
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Jan 11 01:45:03 2012, 美东)
"[NCAA]rayfalls Jan 9. ● 200个巴马夺冠包"
成功扣除 2200 伪币的用户: rayfalls
成功奖励 10 伪币的用户: wrnmb, smartknife, mitmagic, laridoff, niuniu522,
aihebb, joa, werther, miroku, BigAL, takecare, isabella7139, phonemodem,
noles, Renshaw, hancoke, arescor, tosea, hbcco, brmj, YouRFree, GGYY,
Ranma98, soulvirus, meflying, oligomer, cellneuron, welan, bobolink, yourday
... 阅读全帖 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 15 DTT是还原二硫键用的，一般用来保护蛋白不形成oligomer。在这里估计是用来保护T4
DNA ligase的。 |
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p****s
发帖数: 3153 | 16 I am doing something related to it, not the AD itself
The popular view is that the soluble oligomers of Abeta is the main cause of
the disease, proposed by big bull Chris Dobson and others. Anyway, Abeta is
a great model for biophysicists, so if it really causes the disease is a
less important questions for them, at least for me. XD |
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e**r
发帖数: 1144 | 17 比如这个
Wnt signals across the plasma membrane to activate the β-catenin pathway by
forming oligomers containing its receptors, Frizzled and LRP
Feng Cong*?, Liang Schweizer and Harold Varmus
- Author Affiliations
Cancer Biology and Genetics Program, Sloan-Kettering Institute, Memorial
Sloan-Kettering Cancer Center, New York, NY 10021, USA
? Author for correspondence (e-mail: f*******[email protected]) |
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a****o
发帖数: 1786 | 18 Did you use agarose or polyacrylamide gel?
Try to add some BSA and tRNA as nonspecific competitors.
Does your protein tend to form oligomer?
You can also try to add some DTT. |
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w******e
发帖数: 1187 | 19 I used native PAGE gel. I kinda hesitate to use competitors as I
don't know how that would affect aptamer band formation (e.g., would
there be an aptamer-BSA band if I add BSA?).
I also suspect oligomer, but even that can't explain why all my
aptamers are sucked onto it...@@
BTW, I actually tried doing ELISA against the same target using
biotinylated RNA, and that worked out fine. |
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w****k
发帖数: 6244 | 20 it's a good hypothesis, and it can explain why amyloid plaque is not well
correlated to the pathology.
Since the oligomer is toxic, deposition as plaque is relatively protective. |
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b****n
发帖数: 311 | 21 yeah, I know it is a good one, more plausible than the plaque hypothesis. I
really want to hear some insider's view about oligomers and their receptor.
PrPc paper looks nice, but was soon challenged by a PNAS paper using a
different animal model, later Strimatter provided in vivo evidence for PrPc.
I am kind of lost...
. |
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l**n
发帖数: 109 | 22 0.1mg可以试跑自然胶再切胶回收
用1ml的mono S或者mono Q也有可能分开monomer和oligomer，应该比gel filtration的
回收率高些 |
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c********o
发帖数: 139 | 23 这些抗体真的是能够只识别oligomer，而不识别monomer吗？另外用Th-S不能作为淀粉
样多肽识别的分子探针吗？是否可以取代免疫识别？ |
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T**********t
发帖数: 1604 | 24 Analytical Ultracentrifugation可以判断monomer/oligomer状态，但是需要的蛋白量
比较大。一个样品体积要大概400ul，absorbance最好在1左右，而且做完基本就废了，
拿不回来了。 |
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O******e
发帖数: 4845 | 25 You are right. But I'm more comfortable of using native gels to study
oligomers. |
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C*******e
发帖数: 4348 | 27 rt
跑SEC遇到一个情况
样品里有3个蛋白，100 kDa，60 kDa，25 kDa
然后收集的洗脱峰跑胶发现
60 kDa先出来
再后来出来的是100 kDa和25 kDa一起
有什么可能会这样呢？
首先我肯定100 kDa不是25 kDa蛋白的oligomer形式
有wb及urea变性跑胶为证 |
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h********r
发帖数: 519 | 28 现在最重点的是soluble ab oligomers, rather than ab fibrils or monomers, are the most toxic species. The origin of ab toxicity may come from the membrane-disruption. Ca overload may be consequence of membrane disruption due to the formation of ion channel. |
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e****s
发帖数: 1125 | 29 你这里说的和我理解的allosteric effect有点点不一样，我对这些确实不大了解，可
能理解有偏
差。 我理解的是第3者的远程的结合引起一个蛋白构象的改变，从而影响和另一个蛋白
或者底物的结
合。另外一点，LZ可以看一下你的蛋白是单聚体还是多聚体。通常认为oligomers 相对有
allosteric effect的机率更大。
你说的这个现象肯定存在，但更像是misfolding带来的？所以不管怎么突变，一定要检
测该蛋白的主
要活性有否明显的变化，酶起码测酶活，蛋白起码检测主要功能,CD之类的也行。标记
前后也得比较活
性。
话也说回来，有一天心血来潮想了个Idea，想做两个蛋白间的结合，结果发现以前发表
的结合位点完全
错误。于是就来兴趣想确定这两个蛋白的相互结合位点，结果1年半了，还没有Promising的
结果。估计那
个大牛组里的也是逼急了，编了个故事出来。当然走了不少弯路，组里也没人做这个的。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 30 没用过RACE kit
但是做过RACE
你要3'不？
基因多长？
我用的RLM-RACE，就是RNA ligase mediated RACE
你搜文献应该能搜到
具体就是利用RNA ligase可以连ssRNA+ssDNA
合成DNA oligomer，上面有一段adaptor sequence（跟你的目的基因/目的基因组没有
同源性就行），5’端和3’端都要-OH吧，然后RNA ligase会催化把这段DNA连到mRNA上
，再做1st strand cDNA synthesis
然后用gene specific reverse primer和adaptor forward primer (可以是你前面用的
adaptor，也可以重新设计引物，往里面来一点，做巢式PCR）来扩你要的基因
这样子好像应该比$740便宜很多 |
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S*****3
发帖数: 720 | 31 “中国百篇最具影响优秀国际学术论文” 评选所选论文代表了我国科技论文发展的最
高水平。论文源为前一年被SCI（科学引文索引）收录的中国论文。评选综合考虑发表
论文的期刊水平（影响因子和单篇引用次数）、论文类型、热点论文、论文的合作强度
、参考文献数和论文的完整性等方面。
其中生物类包括：
论文题目: Acute promyelocytic leukemia: from highly fatal to highly
curable
论文作者: Wang, Zhen-Yi; Chen, Zhu
所属机构: 上海交通大学医学院瑞金医院
来源期刊: BLOOD, 2008, 111(5):2505-2515
被引次数: 29
作者简介：
陈竺
卫生部部长，中国科学院院士，博士生导师
白血病系统生物学研究组组长
论文题目: Sorting of small RNAs into Arabidopsis argonaute complexes
is directed by the 5 ' terminal nucleotide
论... 阅读全帖 |
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m***o
发帖数: 272 | 32 有什么原因吗？
做realtime RTPCR， 自己上网设计的引物如果用one step,竟然一点不能得到产物，但
如果仅用来做PCR，就可以得到很干净的条带。所以想在one step 里加random primer
来RT，但是好像很多kit都是只用gene 的primer来RT。不知有啥讲究。
谢谢！ |
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w******n
发帖数: 767 | 33 没啥讲究吧，只不过用不着random了。我有时检测多个gene，用oligo(dt),做完反转录
，取RT产物可以检多个gene，没有问题。
primer |
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m***o
发帖数: 272 | 34 谢谢ｗａｋｅｓｍａｎ回复。
就是说你用的还是２step RT-PCR了？我现在还是需要做ｏｎｅ ｓｔｅｐ，就想试着
往ｋｉｔ里add random primer是不是可以有特异条带生成。 |
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n********k
发帖数: 2818 | 35 why u "have to" do one step RT-PCR? I am pretty curious...BTW, how long is your amplicon? for QPCR, best be below 150bp, something around 50-100bp would be good...virtually every pair works if one uses a reasonable software and pick the top choices...I use IDT's website to design it... |
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h*******o
发帖数: 4884 | 36 没有完全看懂楼主的意思 , 个人理解
所有的One step RT-PCR kit都不可能用gene specific primer来做RT这一步
都是用的oligodT之类的primer来做RT,然后在接着标准的PCR而已
只不过对Taq的要求高一点而已,需要HotStart Taq
user自己加入自己的specific primer for gene of interest.
整个mixture其实就是先RT在PCR, 一般Protocol都要求42度1小时RT,然后直接65赌灭活,再开始PCR的cycle.
我以前用过很多One-step RT PCR,如果不出条带一般是自己的引物的问题
至于One-step realtime PCR 没试过
primer |
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w******n
发帖数: 767 | 37 用的就是one step kit，我的kit是先45分钟，然后正常pcr cycle, 这45分钟就是在RT
,所以我用oligo dt到这一步就停下，后面用这个做模板pcr.加random应该没问题，我
一次加过两种引物。试一下就行，也不费劲，不过你的没有条带，不一定是这个原因。 |
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w******n
发帖数: 767 | 38 从哪儿看出来LZ用了degenerated primer, random?
Synthesis/index.html
primers can be used for RT reaction:
with each having its pros and cons. |
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l**********1
发帖数: 5204 | 39 from his/her sentence
>做realtime RTPCR， 自己上网设计的引物 mRNA as template 用one step RTPCR, then 自己上网设计的引物 PCR
竟
然一点不能得到产物
but with direct genomic DNA as template 自己上网设计的引物 可以得到很干净的条带
then you can IMAGE that---
because he/she did not have the full 3' UTR end that target full sequence information
so he/she used degenerated primer+oligo T tails for one-step qRTPCR
otherwise without below his/her 0F paste.
---- |
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l**********1
发帖数: 5204 | 40 if your target mRNA its 3' UTR super long (over several kp) tor before the stop codon high GC rich region
then you can only get with normal qRTPCR then PCR whole 3RACE PCR products.
This case please try another method:
: ligation-anchored PCR cloning
一句话就是用内切酶对应的人工引物锚定: 3'端 做人工锚定引物PCR
mRNA with a primer (3'-poly
(dT)17 with an anchor sequence at its 5'end, then qRTPCR then PCR sub cloning... sequencing.
References:
//genome.cshlp.org/content/4/1/19.full.pdf
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles... 阅读全帖 |
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w******n
发帖数: 767 | 41 one step rt-pcr用的就是 gene specific primer RT,说明书里通常说不推荐用random
或oligo(dt).
活,再开始PCR的cycle. |
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h*******o
发帖数: 4884 | 42 了解了
原来我一直以为one step RT-PCR的master mix里面有oligo dT之类,用来做RT step
然后user 自己加入的gene specific primer只是用来扩增用的
hoho, 傻兮兮的用了好几年都不知道原理
谢谢!
random |
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l**********1
发帖数: 5204 | 43 Your original thought is regular 3' RACE
oligo dT its target is poly (A) tail
but for super long 3' UTR (over 3 kp) mRNA that regular 3' RACE does not work
from even you do not know the extension time for that PCR before your did
Northern Blotting or similar experiment for knowing the full length of 3' UTR region. |
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w******n
发帖数: 767 | 44 其实我也不知道你在说啥，他的primers是work的，下游primer应该不会设计在3'UTR。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 45 楼主 没有确定的可以general qRTPCR的两组碱基序列才会问这个贴的吧
有时候就得用特殊的anchor adaptor ligation qRTPCR and relative PCRs
details steps 请看图
snap copied and pasted from
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14660366
NB: for which kind of restriction enzyme that fit to your target,
case by case just by your PCR cycling and Gel Image and sequencing cycles again and again
and your fate probability. |
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l**********1
发帖数: 5204 | 46 oligo dT 没错 如target gene 只有一段很短的碱基序列(<120bp) 已知
而没有任何其上游5' 或下游3'的序列信息
只能用oligo dT qRTPCR 从poly A tail 揪出那条mRNA to single strand cDNA
then to double strand cDNA the 附加带酶切位点的各种adapter
再用那些人工加入的带确定碱基序列的 adapter 5' to 3' 对应的 反链 3' to 5' 的引物
PCR cycling
具体步骤请看图:
snap copied and pasted from
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC50225/ |
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w******n
发帖数: 767 | 47 你想复杂了，lz这个是已知基因，而且他有序列。one-step qRT-PCR是用下游引物起始
合成CDNA第一链，但是他的引物不work，想加入random合成第一链，这个做realtime可
能有问题，random会产生非特异带，影响定量，建议楼主试别的引物，或者两步RT-PCR。
的引物 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 48 了解 老大
Ps: LZ 啥时worked 回帖说一下啊
PCR。 |
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s******l
发帖数: 7 | 49 谢谢各位的意见！
酶还是很纯的。
Aggregate 和 inactive oligomers 都有可能，我再做实验检测一下。 |
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c**i
发帖数: 265 | 50 我做了一个A和B的fusion protein。A本身可以形成homodimers，在一定刺激下可以形
成oligomers。原本设计是利用A的oligomerize来激活B蛋白，但实验发现B蛋白在非诱
导下也有一定的激活（由于homodimers），但在刺激下活性加强。
现在使用的是一个GGGSGGGS的flexible linker，请问大家有没有可能通过使用rigid
linker来分开B蛋白，使得即使A形成homodimers，B也由于不可自由移动而无法
dimerize。在刺激下，B则和cluster中的其他B蛋白dimer而达到减少背景的目的。
谢谢大家了。 |
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