p****z
发帖数: 31 | 1 最近想用retrovirus转一个基因,用的是pBabe-hygro,addgene protocol上推荐的细胞
系我们没有，隔壁实验市用的是Phoniex A,不知道这个细胞系可以用来转pBabe-based
vector 吗？老板最近经费不多，不想让费钱在一个可能只用几次的细胞系上。谢谢！ |
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y******y
发帖数: 107 | 2 手头上有一个 pBABE-puro SV40 LT plasmid ，是从addgene买的， 图谱如下连接
http://www.addgene.org/13970
请问一下这个plamid能否表达 SV40 large T antigen( LT). 因为从图谱上看是 SV40
LT gene是插在BamH I位点之间，可是这个SV40 LT gene是在SV40 promoter 之前，另
外一个比较奇怪的问题是为什么有两个SV40 promoter，多谢！ |
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n********k
发帖数: 2818 | 3 I doubt you have done the readings...In short, yes and no...For some, the
lenti packging can be used for Retro(pbabe). So for dividing cells, doesn't
matter much for the infection/integration; However, for non-dividing cells,
presumably no big difference with infection but a huge difference with
integration step(nuclear entry step--which is essentially the key difference
between the two)...So essentially western doesn't tell you much here...
unless they stablize.
BTW, contrast to the common beli... 阅读全帖 |
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y*******i
发帖数: 96 | 4 刚来一个实验室做博后，以前的博后走了，也没有具体的protocol,我们有pBABE和
pBABE-ras retroviral vector. 这些载体是可以直接用fugene-6转染到人的细胞（比
如MCF-7)中，还是需要先把这些载体包裹到virus中，然后再感染细胞．目的是要看到
ras-induced senescence.好像文献中都是需要packing,然后再感染细胞．
多谢 |
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m**********d
发帖数: 137 | 5 之前做过很多lentivirus，都是超速离心virus之后infect细胞，transduction效率都
还不错，这次偷懒没离心，直接用的含有病毒的medium，可是puromycin select一两天
后细胞全死光了，以下是详细的protocol:
vector用的是pBABE-Luc （基于pBABE-puro,只不过也表达luciferase）
293T细胞，养在75cm2 flask里，用lipofectamine2000转染的，包装病毒用的是second
generation packaging system (PAX2,pMD2.G)
分别于转染后48hr和72hr collect medium，过了一下0.45uM的filter，又加了8ug/ml
的polybrene，就加到要transduce的细胞里去了，24hr之后开始puromycin selection
我能想到的问题可能是准备transduce的细胞有点太confluent了，但这也没法解释全死
光的结果，我想很可能是没有病毒包装，高人们帮忙看看这过程中可能是么出了问题 |
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g*********r
发帖数: 59 | 6 I wonder whether anyone has experience on this retrvirus vector. Tried to
amplify it several time. the plasmid yield from most clones are super low.
Any way to solve this issue?
THanks! |
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a*****n
发帖数: 2835 | 7 try to transform again to DH5a,and make new preparations. |
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F**********e
发帖数: 158 | 8 you are right, this vector get a very low yeild
transform again may help a little
we just use much more bacteria |
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s******y
发帖数: 28562 | 9 Yes, it is very low.
What I did is I picked up several colonies from the plate and then compare
their plasmid yields.
The highest one will be used for plasmid production.
Even so, I still have to shake 500mL culture in order to get 250ug plasmids |
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g*********r
发帖数: 59 | 10 Glad to hear that. I thought I might make some mistakes during midi prep.
I also notice that sequence provided by addgene is not right. I tried to cut
it with kpni.the bands I got differs from predict. |
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X***n
发帖数: 366 | 11 DH5a or Invitrogen Stbl3? It says Stbl3 is better for retroviral vector. |
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z****g
发帖数: 3340 | 14 人primary fibroblast用spinning的方法转染pBabe-puro病毒,感觉puromycin
selection之后,细胞不长了,形态似乎也发生了变化(空载体的对照也是).
有经验的大虾show一下你的经验.前后转了两次都一样,有点失望. |
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s******r
发帖数: 2876 | 15 你这个virus以前用过吗？肯定work吗？
人primary fibroblast用spinning的方法转染pBabe-puro病毒,感觉puromycin
selection之后,细胞不长了,形态似乎也发生了变化(空载体的对照也是).
有经验的大虾show一下你的经验.前后转了两次都一样,有点失望. |
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z****g
发帖数: 3340 | 16 以前从来没做过retrovirus.virus是用cDNA克隆到pBabe-puro后, 1:1与pCL质粒一起转
到Phoenix细胞,两天和三天后收病毒,0.45uM filter过滤后感染fibroblast. 48小时候
开始puromycin selection, 感觉细胞长得很慢很慢 (对照也一样).
另外,construct transient expression很好. |
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s******r
发帖数: 2876 | 17 那你可以先用普通的细胞，比如293，来试试你的病毒，
不用加drug，感染后，western先看看。
以前从来没做过retrovirus.virus是用cDNA克隆到pBabe-puro后, 1:1与pCL质粒一起转
到Phoenix细胞,两天和三天后收病毒,0.45uM filter过滤后感染fibroblast. 48小时候
开始puromycin selection, 感觉细胞长得很慢很慢 (对照也一样).
另外,construct transient expression很好. |
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D***a
发帖数: 516 | 18 我们就和两个retrovirus包装质粒混好，转293T。 |
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j********r
发帖数: 156 | 19 最近一直在尝试overexpress a gene in primary epithelial cells, but always
failed to get decent level of expression。望版上诸位帮看一下。
我用的是一个类似与pBabe的retroviral vector, the gene was tagged with GFP or
Flag on the c-terminal. The target cells were infected twice and then
subjected to antibiotic selection (blasticidin in this case). 用anti-
Flag做western, 勉强能看到带，如果用the ab against itself, 可以看到exogenous和
endogeneous的差不多 （the endogenous level is already very low, which is
also the reason that we hope to increase it to ... 阅读全帖 |
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C**S
发帖数: 522 | 20 pBABE是Retroviral的
second
ml
selection |
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s******y
发帖数: 28562 | 21 手头上有一堆retroviral vector (pBabe and pQC, PsR, etc.) 一直都是
用retroviral packaging system (GAG/PoL + VsvG)
最近想用lentiviral system,以前从来没有用过，所以想问一个白痴问题，
就是能不能直接用以前的vector装到lentiviral packaging system里面?
随便看了看lentiviral 的说明书，貌似好像没有问题？ |
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s**********a
发帖数: 92 | 22 大家好，
对于病毒载体，也像一般plasmid那样，瞬时转染后提蛋白，做western鉴定么？
还是收集上清直接做infection，然后再western鉴定呢？谢谢！
我的情况是：pBABE载体，瞬时转染293后，提蛋白，做western没蛋白表达。 |
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f*********6
发帖数: 94 | 23 想immortalize人的原代细胞，用了pBabe-hygro-htert。折腾了有段时间了，却没拿到
cell line.想有个tag会显示转染效率。有lenti的就更好了。请问那位能给我匀一点？
请站内联系。谢了先。 |
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g*********3
发帖数: 177 | 24 感谢大家的帮助～
前天看到有同学回贴，谈到在5-3LTR之间插入Poly A的问题，有篇文章http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18627247 有一些结论
BTW，大家能否给些建议关于weak promoter，在lentivirus中的prmoter很多都太强，
如果我想要subendogenous的蛋白表达量，哪种promoter比较好用～
老板推荐说pBABE/pLXSH的LTR promoter不错，不过我查了下文献 好像证据不是很多。
做过的同学给点建议～
先谢过大家了 |
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f*******e
发帖数: 354 | 25 pbabe是retroviral的吧，LTR表达量其实也很高 |
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p****z
发帖数: 31 | 26 查了一些文献，很多都写得不是很明确。想用pBabe-based的virus去infect THP-1和
MOLT-3这两个细胞系。
在sigma看到一个，其中有一步是加入virus之后离心半小时，之后就立刻把上清去掉，
不甚理解，所以不敢用。
谢谢大家！ |
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m*******n
发帖数: 387 | 27 试了下，western可以看到条带
但是没看到文献报道
跑过来请达人确认下
多谢了 |
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m*******n
发帖数: 387 | 28 快沉了
自己顶下
我就是用lentivirus包装的方法
然后感染，感觉work
不过没听说怎么做的，除了在版好像见过一次
就去试了下 |
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l*******u
发帖数: 449 | 29 不同病毒包装的质粒用的是不一样的
通常，retro的不能用于lenti
但是，没有试验过 |
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s******y
发帖数: 28562 | 30 很久很久以前我问过这个问题，当时的回答是：
能包进去，但是效率不会高。 |
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m*******n
发帖数: 387 | 31 western跟pLM letivirus的带我gene的vector比
感觉两个的条带差不多呢
好奇怪 |
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m*******n
发帖数: 387 | 32 谢谢回复。我是在MCF7细胞里面做的
下次做个IF看看infeciton的效率
t
,
difference
cells
virus, |
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C**S
发帖数: 522 | 33 我最近也在装一个载体，把一个5k的基因装到pEGFP－C1载体再把GFP fusion蛋白装到
pBabe retroviral里。酶切测序都对，就是转到293T细胞里只能看到极少数细胞GFP阳
性。真的是因为基因太大了？谢谢。 |
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