d********r
发帖数: 211 | 1 需要很多PBMC, 所以从Donor取不现实.
发现有一些公司卖, 哪个公司比较好? |
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h******t
发帖数: 56 | 2 最近开始culture PBMC differentiated macrophages, 第一天用deads 分离出来的时
候cell还挺好的，都贴墅生长了,可是第二天一看很多cell凑成团,还有将近一半的cell
悬浮了.所以上来问问各位牛人,这种现象正常吗?还是我的操作有什么问题.谢谢! |
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f*****m
发帖数: 24 | 3 I am going to in vitro differentiate TH17 from human PBMC. Does anyone has a
reliable method that has a good yield? I know it is a very tricky field.
Thanks |
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n*********s
发帖数: 552 | 4 human IgG + goat anti human stimulate PBMC. 做了好几遍，24小时都检测不到TNFa
，估计是抗原抗体比例不对，网上查了一下实在没有好的protocol，不知道有人能
share一点经验或者有protocol可以借鉴吗？先谢了。 |
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f****6
发帖数: 365 | 5 此版上很多智者，不才想向大家请教：
去年进了一家10个人的私人小公司。公司做肿瘤的免疫治疗-疫苗治疗。目前临床1期。
我进公司之前，公司只有一个免疫学的PHD，此人是director，手下一个技术员。我进
公司之后，我的直接老板是 此director。
他们从10ml 的病人血中，最多能分离出2个million 的PBMC，他们做了快一年。我进公
司后，用我的方法可以至少分离5个million 的PBMC，一般是7-8个million及以上 的
PBMC.我的方法很平常，在Google花一分钟查一下就知道了。我很奇怪我什么此一
director及技术员一直知道细胞数不够做试验，但是在google 上查一下的动力都没有。
我也改进了细胞的抗体染色方法。一瓶抗体用他们的方法染一百个样本，用我的方法可
以染500个样本。
我加入之前，他们没有从病人T细胞里检测到过任何细胞因子。我加入之后改进了方法
，找到了一种细胞因子。
这家公司存在大概10年了，他们都是老员工，只有我是新加入的。他们的试验设计不合
理到让我感到震惊！我不得不感叹，他们的命真好啊！既不勤奋工作，又没有能力工作
好，竟然在工业... 阅读全帖 |
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A******y
发帖数: 2041 | 6 PBMC. Write an IRB protocol for blood collection and fico isolate the PBMC.
You should get millions from just 5 mL of bloods.
Or you can buy PBMC from many suppliers. |
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f****6
发帖数: 365 | 7 去年进了一家10个人的私人小公司。公司做肿瘤的免疫治疗-疫苗治疗。目前临床1期。
我进公司之前，公司只有一个免疫学的PHD，此人是director，手下一个技术员。我进
公司之后，我的直接老板是 此director。
他们从10ml 的病人血中，最多能分离出2个million 的PBMC，他们做了快一年。我进公
司后，用我的方法可以至少分离5个million 的PBMC，一般是7-8个million及以上 的
PBMC.我的方法很平常，在Google花一分钟查一下就知道了。我很奇怪我什么此一
director及技术员一直知道细胞数不够做试验，但是在google 上查一下的动力都没有。
我也改进了细胞的抗体染色方法。一瓶抗体用他们的方法染一百个样本，用我的方法可
以染500个样本。
我加入之前，他们没有从病人T细胞里检测到过任何细胞因子。我加入之后改进了方法
，找到了一种细胞因子。
这家公司存在大概10年了，他们都是老员工，只有我是新加入的。他们的试验设计不合
理到让我感到震惊！我不得不感叹，他们的命真好啊！既不勤奋工作，又没有能力工作
好，竟然在工业界工作. 成千上万既勤奋工作，又有能... 阅读全帖 |
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p****l
发帖数: 291 | 8 If you only want to clone IgG1 heavy chain, I think with one step more to
purify B cells from PBMCs will be better than PBMCs.
As for human B cell line, I think most of them should be from B cell
lymphoma. First, you do not know whether they secrete IgG1, second you do
not know how their DNA changed.
I do not know to what extend the gene of IgG1 heavy chain preserved in
different B cell clone, but definitely this is what you must take into
consideration.
And I think it will be better if you can |
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c******r
发帖数: 3778 | 9 唉，这确实是个概念问题。
首先，现在认为从正常细胞变成cancer cell需要经过multiple steps。所以每一个不
同的stage都可以有细胞系。
1. 正常细胞。最常见的，比如我们的PBMC，fibroblast等，还有很多其他的细胞。当
然这样的正常细胞难以成为细胞系。因为会senescense，不能长期繁殖。不同species
的细胞能够繁殖的代数不同，人类的好像多数在10-20代左右（看donor的年龄等），但
是都不能无限繁殖。我们买到的，一般是经过几次传代扩展的low passage cell。不同
batch可能是不同的donor。
2. immortalized。正常细胞经过一些处理可以成为immortalized cell line。最简单
的，比如我们的PBMC用EBV感染一下，可以immortalize B cells。其他还有很多方法，
比如用chemical筛选等。immortalized cells不会senescense，可以无限繁殖，但是仍
保留部分正常细胞的性状。具体是那些，跟正常细胞区别有多大，要看具体的细胞系，
和处理方法。这样的细胞系... 阅读全帖 |
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r****e
发帖数: 1375 | 10 hehe
http://www.sciencemag.org/content/334/6053/176.1.full
Science 14 October 2011:
Vol. 334 no. 6053 p. 176
DOI: 10.1126/science.334.6053.176-a
•Letters
Partial Retraction
In our 23 October 2009 Report, “Detection of an Infectious Retrovirus, XMRV
, in blood cells of patients with chronic fatigue syndrome” (1), two of the
coauthors, Silverman and Das Gupta, analyzed DNA samples from chronic
fatigue syndrome (CFS) patients and healthy controls. A reexamination by
Silverman and Das Gupta of... 阅读全帖 |
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d********r
发帖数: 211 | 11 也是纯属学术探讨，无意刺探军情，
Q1. 体外扩增T细胞的方法, 哪个或者哪几个最有可能提高细胞产量呢?
1) media formulation 2) media feeding schedule 3) T cell seeding
density 4) T cell: CD3/CD28 ratio. 5)expansion vessel design, e.g.,
agitation speed, media volume etc.
Q2. 倒底需要多少fold cell yield increase啊? 我看到下面的连接第79页,
Leukapheresis (12-15 liter), 不清楚12-15 liter可以取多少PBMC.
12-15 liter whole blood都不可能啊.
我想知道一般大概起点PBMC需要至少多少细胞, 然后里面T cell百分比可以估计, 这样
就知
道starting cell number, expansion 以后目标大概是5-10 billion, 这样就可以估算
需要多少fold increase. 对于某些病人, 可能他们... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 12 湾区一家做癌症检测的创业公司招RA，公司文化透明气氛好，funding 足。需要尽快入
职。关于公司具体细节请联系微信Julie-YH，或请把简历发到[email protected]
Your Primary Responsibilities
- Work within team environment to support development, characterization,
and optimization of synthetic biomarkers.
- Work within team environment to support development and optimization of
novel in vitro assays that identify & characterize cancer types.
- Document results and communicate findings internally to team and to
external partners.
Your Required Exper... 阅读全帖 |
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r***a
发帖数: 72 | 13 稿件题目“Synthesis of a Novel Thiazolidinedione and Evaluation of Its
Modulatory Effect on IFN-, IL-6, IL-17A and IL-22 Production in
Pbmcs from Rheumatoid Arthritis Patients”，杂志影响因子2分多。请相关专业感
兴趣者，提供姓名、EMAIL 地址、研究背景，发送到站内信箱 |
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r***a
发帖数: 72 | 14 稿件题目“Synthesis of a Novel Thiazolidinedione and Evaluation of Its
Modulatory Effect on IFN-, IL-6, IL-17A and IL-22 Production in
Pbmcs from Rheumatoid Arthritis Patients”，杂志影响因子2分多。请相关专业感
兴趣者，提供姓名、EMAIL 地址、研究背景，发送到站内信箱 |
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n******i
发帖数: 374 | 15 需要1-2个审稿人 Acta Biochimica et Biophysica Sinica (ABBS)
题目 iTRAQ analysis of PBMC discovering vimentin to be a potential AIDs
therapeutic efficiency biomarker
请联系我，谢谢。 |
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c****d
发帖数: 501 | 16 我们想从一个B cell line克隆IgG1的heavy chain
不知道可不可行
或者如果随便找个donor 用PBMC的RNA呢
本人之前不是做免疫的 还请大家指点 |
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c****d
发帖数: 501 | 17 恩 我们先是自己design了一个长的primer
就是根据pubmed找到的IGHG1的序列
结果还真从我老板的PBMC当中捞到一个clone
就是mutation太多了
不知道你用过这类的primer kit吗
是clone用的 还是一般的genotyping用的 或者是realtime pcr用的呢
我也是糊里糊涂的 但是感觉这些应该是不一样的 |
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c****d
发帖数: 501 | 18 first, thanks a lot for the reply!
像我上边说的 我们最初就是用我老板的PBMC提RNA试了一下
用的是clontech的RACE的kit
结果批出来一大堆乱七八糟的东西里 还真捞出来一个IGHG1
可惜和genebank的序列align的结果有很多mutation，大概对上97%
我也不知道是pcr的fidelity的问题 还是个体差异
然后我们就用了CESS cell line, suppose是分泌IgG1的 而且刚好有我们要的membrane
bound form
repeat了同样的试验 这次批出一个非常specific的band， size也对
结果测序之后 竟然是完全不同的东西
blast了一下 发现target到genome上一个未知的loci
然后我就卡到这了 ：（
is |
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x*******e
发帖数: 111 | 19 如果用血的PBMC做ICS,可以先冻存起来,对ICS结果影响不大.如果是组织,必须拿新鲜的
做ICS. |
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m*****u
发帖数: 15526 | 20 工作量肯定是不一样的。对于典型的集落，用不着做免疫染色和flow。或者挑几个做就
可以了。而且集落细胞数有多少，有多少集落完全可以估计。对于mix在一起的，只能
所有都做，每个集落细胞数量类型无从估计和比较。
至于在液体还是半固体中分化是否会不同，我没比较过。记得看过报道是跟液体培养有差异。差异多少不好说。即使都是半固体，methylcelluose 和软琼脂性质也不同。液体培养要换液，加fresh的细胞因子。换液可能导致细胞丢失，麻烦而且不太容易控制条件consistent。无论你用什么纯化方法，能形成集落的细胞只是其中一部分。用半固体培养基可以很方便的估计其中集落形成细胞的数量比例。不管是PBMC还是CD34。用单克隆接种要看的累死也未必能找到几个CFC。另外，单克隆细胞生长一般都会比细胞群体要差
谢！ |
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m*****u
发帖数: 15526 | 21 半固体培基主要目的是估计你的细胞样本中colony forming cells 的数量，功能和类
型。无论你用PBMC还是CD34,能形成colony的细胞只是其中一部分。根据colony的数量
，形态，大小，颜色可以知道血细胞红系，粒系，单核巨噬各系progenitor的分布和
colony形成能力。在液体培养中，所有分化的lineage都mix一起，和不能形成colony的细
胞也混在一起，这样这些就都无法判断。 |
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f********s
发帖数: 115 | 22 你说的很多我都同意。只不过现在我想定量的的来分析一种特定的 progenitor （ex.
CMP） 分化到各个lineage 的能力。我觉得在把多个progenitor 接种到同一个盘子上
有几点非常影响我做定量分析：
1.你在挑集落的时候是可以看到集落的样子的，所以也许你会不自觉的多挑或者少挑某
些集落，引入bias;
2.在挑集落的时候，大的集落容易挑出来，小的集落不容易挑，即使挑了小集落在后续
实验过程中不知道怎么就不见了 (而且大小通常意味着不同的lineage)，也会严重影响
实验者的判断。
因此，我觉得一定要接种单细胞到96孔板里，在不看孔的情况下, 随机挑选比如说20个
孔来观察，这样可以得到各种百分比，比如说百分之多少的单细胞能形成集落，百分之
多少的细胞能形成红细胞集落，多少能形成粒细胞集落……不知道关于这一点你是否同
意？
在这个基础上，我想知道半固体和全液体培养基在这个实验里的优劣。我能想到的半固
体的坏处在于，1.如果你不看孔，不知道这个克隆在哪里，你就要把全部的200ul半固
体培养基吸出来，非常不利于cytospin. 2.而且半固体培养基会有一部分粘在t... 阅读全帖 |
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c********1
发帖数: 2 | 23 最近在做NK细胞的培养，留意到从人PBMC中分离得到的NK细胞总是聚团生长，
1. 请教各位大牛这是什么引起的？
2. 而似乎NK细胞的活性越好，聚团现象就越明显，这是为什么？
3. 对NK细胞给药处理后，发现细胞完全不聚团了，但是仍然是活的的，这可能是影响
了什么造成的？ |
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W****C
发帖数: 1937 | 24 养macrophage要用conditional medium吧 |
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h******t
发帖数: 56 | 25 对了，忘记说了。我用的是RPMI+10% heat inactivated FBS+PEN/STREP和50ng/ml GM-
CSF |
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s****u
发帖数: 483 | 26 what kind of beads did you use? i suppose you are using them to isloate CD14
+ monocytes for macrophage differentiation. Otherwise, it's not suprising to
see dead T cells in your culture.
cell |
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h******t
发帖数: 56 | 27 多谢回答,我用的beads是invitrogen的untouched monocytes isolation beads，而且
cd14 positive cell 有96%+这么高, 所以我觉得应该没有多少T cell contamination. |
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m*****n
发帖数: 5245 | 28
抗体标记估计很难找。
如果收集患者的血清，进行cytokine/chemokine的profiling，
同时，收集患者的PBMC，通过FACS进行免疫细胞表面标记的profiling；然后用相关的
免疫药物处理，通过PCR分析cytokine/chemokine的表达差异，这样的immuno-
profiling是不是也可行？ |
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L**S
发帖数: 7833 | 29 求同存异。
上bbs，就是一乐而已。
我们老板就很极端，说不用human primary immune cells做的免疫，都是扯淡，PBMC养
出来的DC，macrophage都不能算。
看看乐一乐就好，呵呵。
免疫是一个很大很有趣的领域。不要被生化局限了思维。 |
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w******y
发帖数: 4871 | 30 IL4 (th2 cytokine), IFN-r (th1 cytokine) 都有elisa kit的。
我在做。不过我们是把外周血的pbmc提出来后做3 day or 11 day culture, 然后测
supernatant 里的cytokine level. |
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B*******l
发帖数: 41 | 31 多谢! 这种应该是免疫过的动物pbmc与抗原Coculture吧。 |
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t******n
发帖数: 33 | 32 First, thank you very much for any suggestions on this problem.
I am running ADCC assay with human NK cells activated by IL-2 overnight. I
got ~100% killing of the target cells when cultured with activated NK cells
even without antibody, please refer to the data below.
________________________________________________________________
Target cells were labeled with Europium.
Target cells+ Effector cells (no antibody treatment)
average 338662
Target cells+ Effector cell... 阅读全帖 |
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l******a
发帖数: 3339 | 33 你用了多少effector cells，1/10吗？
cells |
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t******n
发帖数: 33 | 34 Yes, I used E:T=10:1. NK cells=100,000cells/well, target cells=10,000cells/
well in 96-well round bottom plates.
After overnight culture in RPMI1640+GlutaMax+Sodium Pyruvate+10%FCS+10ng/ml
IL-2 at 1.0x10e6cells/ml, I mixed the NK cells with target cells and co-
cultured for 2 hours. I got ~100% killing of target cells even without any
antibodies.
When I removed IL-2 from the medium and cultured NK cells overnight, I got
the same problem:~100% killing after co-culture with target cells for 2
hour... 阅读全帖 |
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O***n
发帖数: 13127 | 35 not use anti-human IgM for B cell stimulation?
TNFa |
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n*********s
发帖数: 552 | 36 谢回复。不过我们主要做immune complex 刺激monocytes 的。 |
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h******y
发帖数: 351 | 37 我们公司位于马里兰Rockville，是一个startup，方向是细胞治疗。公司现在有一个
opening，需要有免疫学或细胞生物学的背景。具体要求请看下面。
https://onedrive.live.com/redir?resid=BD682A26A4E7C162!11236&au
cm6_q_zSBI&ithint=file%2cpdf
有兴趣的请和我联系。Please submit your resume to [email protected]/* */
公司背景请看 http://www.propagenix.com
Job Description:
We are seeking a highly motivated and creative Staff Scientist, Immunology
to join Propagenix Inc. in Rockville, MD. This exciting opportunity will
focus on regenerative cell therapy and involves extensive ha... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 38 湾区一家做癌症检测的创业公司招RA，公司文化透明气氛好，funding 足。需要尽快入
职。有兴趣请把简历发到[email protected]
Your Primary Responsibilities
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and optimization of synthetic biomarkers.
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novel in vitro assays that identify & characterize cancer types.
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external partners.
Your Required Experience, Knowledge and... 阅读全帖 |
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e*n
发帖数: 1511 | 39 你先看这个：
http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00971334
Further study details as provided by Sequenom, Inc.:
Biospecimen Retention: Samples With DNA
Plasma and PBMCs
Estimated Enrollment: 6600
Study Start Date: August 2009
Estimated Study Completion Date: June 2010
Estimated Primary Completion Date: March 2010 (Final data collection
date for primary outcome measure)
看三月份primary outcome都出来了， 六月份就完全结束。
SAN DIEGO, May 12, 2010 /PRNewswire via COMTEX/ --Sequenom, Inc. (Nasdaq:
SQNM) ... 阅读全帖 |
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