s********n
发帖数: 248 | 1 我用过cell signaling 的pAKT T308,这个克隆是最好的
http://www.cellsignal.com/products/2965.html
block 用5%milk/PBST (0.02% TWEEN 20), dilute primary antibody in either 5%
milk or 5%BSA/PBST, 4 degree overnight.
quick wash 2/3 times, then wash 3 times*5 min with PBST,
dilute 2nd antibody (JACKSON LAB HRP-GOAT anti-Rabbit light chain) 1:2500 in 5%MILK/PBST
(如果杂带多，需要把二抗稀释在5%milk里), RT for 1h; 如果杂带不多，可以稀释1:
15000 in PBST, RT for 45min。
quick wash 2/3 times, then wash 5 times*5 min with PBST. |
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i***0
发帖数: 160 | 2 It turns out great with 100 mM NaCl PBST washing. In addition to that I
increase wash times from 3 to 5, and rinse with fresh PBST before put the
membrane in PBST wash box. |
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s***a
发帖数: 384 | 3 发的时候巨慢，想加一句话的，后来就瞬间给发了。。。-_-|||
接着实验室的故事。
早上一到实验室看到台子上老板用marker巨醒目的用大体字写着：
PFA是非常有害的！！必须要放在通风橱里用！！否则会危害其他人！！blabla！！！
然后旁边摆着俺的一个试验杯，盖了两层铝纸
还在想呢，昨天里面是PBST+gelatine，谁给俺装成PFA了？接开一闻，没味啊。。。不
确定是在说俺呢
接着进了办公室，看到所有的同事都以同情的眼光看着俺。没有说话，其实是还没喝咖
啡醒过来呢。。打开信箱，看到老板一封群体信件，警告所有的人注意不要放PFA在试
验台上blabla。每次杀鸡都会送群体信件。看来俺真的是只冤鸡了。
好心的同事还安慰俺，俺告诉他们实情，说想跟老板谈谈，这样其实打击积极性地 (以
前还会赶结果，现在5点就走，实验放下明天做)。同事后来劝说没有用，这里的每个人
都是这样过来的。老板娘每天都会站在试验架子后面监视谁在干什么。这两天俺就觉的
老是有火辣辣的射线投过来。自嘲说俺这是有吸引力，让老板娘的目光都不能离开。。
。:D
当然后来告诉老板他们了，不过也就一个ok完了。
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r****o
发帖数: 105 | 4
blot stripping buffer:
100mM beta-Mecaptoethanol
2% SDS
625mM Tris.Hcl pH6.8
To make 50 ml stripping buffer:
41.5ml ddH2O
5ml 20% SDS
3.125ml 1M Tris.HCl pH6.8
0.352ml beta-Mecaptoethanol
To use the buffer to strip the blot:
1. incubate the blot in the stripping buffer for
30 min at 70 celcius degree
2. Wash the blot with PBST five times
Note: this protocol's condition is very hars |
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I***a
发帖数: 13467 | 5 两种都用过，
差不多，
PBST可能背景干净点。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 9 一秒钟手会晃，容易出鬼影
我也和楼主分享一下我的经验：就是把膜用PBST 洗一洗,
然后把ECL PLus 直接用PBS稀释5~6倍再放到膜上。 |
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g*******f
发帖数: 427 | 10 在PBST里多加一点T试试，多洗几次，如果一片黑的话可能还是因为洗得不够。我觉得
这种方法本身就很 tricky ，如果让我审稿我一定会让用其它方法来验证 dotblot 的
结果 |
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F*****e
发帖数: 182 | 11 泡在PBST（0.1% Tween-20)里，4度放几天，可以降低一些background。 |
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B*****e
发帖数: 1005 | 12 只放在PBST中，没有BSA和milk，-20中，可用很久。 |
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m*********e
发帖数: 378 | 13 THANKS SO MUCH!!!!!
^o^
in 5%MILK/PBST |
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m*********e
发帖数: 378 | 14 还想问一下 你是用什么显色的，ECL, ECL plus,还是pierce 的pico,duro什么的
in 5%MILK/PBST |
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s******y
发帖数: 28562 | 15 要用PBST, 而不是PBS 来溶解，就很好溶了 |
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g*o
发帖数: 769 | 16 今天又试了下，终于转成了，不过具体原因还是不清楚
1. 换了海绵 （not likely the reason）
2. 倒掉了soak海绵的old transfer buffer，用了新buffer （not likely the reason)
3. 用了新裁的一块硝酸纤维素膜，和一张MeOH浸泡过的PVDF （maybe this is the
reason)
4. 和小胖分用不同电源，减少干扰的机会
回楼上，电源的可能性不大，原因：
1. 我用同一个电源跑胶就好好的，电源本身不该有问题
2. 昨天发现没转好，换小胖的reused buffer又转了1hr，一点改善都没有。而可以确
定，那一个小时肯定没有接触不良或电源断开之类的情况
怀疑膜可能是之前转膜失败的祸根：
昨天尽管转的很失败，还是把两块膜都1st ab过夜了，今早发现一块膜惨白（毫无任何
marker），另一块有透明感但边缘也有少许惨白的部分（弱而fussy的marker）。后者
做完了显影，脏脏的没有任何用处。前者惨白的膜就丢在PBST里，后来发现它也变的有
通透感，只中间还残余点惨白的部分，后来整块膜都变通透感，更像... 阅读全帖 |
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h*******o
发帖数: 4884 | 17 I think all you need is to include an No-primary antibody control.
For example, you have mouse sections, and your primary antibody is rabbit
anti-mouse
for your sample: dilute your primary antibody in your incubation solution (
normally PBST + 5%-10% horse/goat serum), followed by washing. then your 2
nd antibody will be horse/goat anti-rabbit antibody in incubation solution.
For your control: just use your incubation solution without primary antibody
.
This is particularly important if your pri... 阅读全帖 |
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g********0
发帖数: 6201 | 18 抗体不怕反复冻融。
抗体的腐败反而是由于它的亲密战友-所谓工作液里起降背景的脱脂奶粉或BSA的快速腐败而
导致的。
我一向不认为脱脂奶粉或BSA能起多大的所谓降背景的作用。
我用抗体直接稀释在TBST或PBST里，含点triton就行了，我一抗里连叠氮钠都不加的。而如果有奶粉的话，加叠氮钠也没用，该臭就臭。
用完就冻起来，反复用几个月都没有问题。
总之，配抗体的buffer里除了抗体本身不要有其他蛋白，这样保质期就长了。 |
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i***0
发帖数: 160 | 19 I have tried increase wash volume, wash time, times of wash, adjusting
antibody concentration. Occasionally, I got a relatively clean image, but
still not clean. Someone told me I could try add some salt in PBST for wash,
and I am trying it today. I will report my result when I got it. But if you
have any great tricks, please help. Thanks |
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s******r
发帖数: 2876 | 20 这个疏水的圈，怎么画才能牢固，好多时候画完往PBST里面一插，圈都掉了。
还有哪家公司的hydrophobic pen物美价廉，有没有可以推荐的。
另外，染色完了之后，mouting得时候是不是一定要把蜡擦掉，不擦的话效果怎么样？ |
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s*****g
发帖数: 7857 | 21 你就不会不往里插？多把PBST滴到圈里，吸掉--如此反复多洗几次？
mouting我从来都不擦。稍为多点mouting液，用带橡皮头的铅笔轻敲敲盖玻片，然后一
边用个尖tip的真空吸管从边缘把泡吸走了事。最后用指甲液封盖玻片。 |
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j*****9
发帖数: 716 | 22 这个简单，你把PBST之后的slides在PBS再洗一下，再画就好了，我都是这样做的，
用的是 liquid blocker by Daido sangyo, made in Japan, |
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s******y
发帖数: 28562 | 23 不要加那个东西，
那个东西会抑制HRP
如果不小心加了，必须注意用普通的PBST or TBST 多洗几次（最少5次），
洗液里和二抗里切切不可再加sodium azide |
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b*********0
发帖数: 4 | 24 PBST(0.01% Triton X-100), 1h, RT. |
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m*********k
发帖数: 10521 | 25 [Stock]
102692 kbrhouston Nov 1 ● 庆祝新班主上任发588个包子
成功奖励 10 伪币的用户: lovefreedom, krobin, eventhere, sunwufan, daledale,
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