r****o
发帖数: 105 | 1 BDscience有专门表达GFP fusion蛋白的质粒卖。比如pEGFP系列。
我用过pEGFP-N1,感觉不错。你不妨试一试。
另外，GFP其实是个结构蛮紧凑的蛋白，即使没有很长的linker，
也应该不会干扰你要表达蛋白的折叠。比如我用的pEGFP-N1的多克隆位点
实际上与GFP就没有专门的linker sequence.但是表达出来的fusion protein
活性很好，而GFP折叠也没有出问题，免疫荧光实验看得很清楚。
如果你实在想加一个linker sequence,可以参考一下pEGFP-N1 多克隆位点
序列。
另外刚才查了一下文献，感觉linker design还是很有讲究的，对于较短的
linker,原则是要用flexible 和hydrophilic氨基酸。Flexible 的氨基酸，比如
Gly和Ala; hydrophilic的氨基酸比如ser。
有些情况比较复杂，较短的linker不行。比如有报道表达一个protein G
和luciferase的fusion protein，中间的linker是GGGGS。发现虽然luci |
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p******i
发帖数: 1092 | 2 我把TLR4 cDNA (2.6kb)从macrophage里PCR出来，加上XhoI和BamHI，接到
pEGFP-N1里，测序结果也是正确的，就是TLR4后面接了个in frame fusion的EGFP
但问题是transfect到293T里不亮，而空载体pEGFP-N1很亮……
我现在怀疑是kozak不够强，准备在ATG前面加一个
GCCACCATGGXX，不知道会不会有帮助……
哪位做过类似的实验，请不吝赐教啊，
在下先谢过了…… |
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s******y
发帖数: 28562 | 3 anti-GFP from Roche is very specific
For you protein, you may want to consider adding a Kozak sequence in front
of your fusion, if you are using the pEGFP-N vector.
The truth is in front of the free GFP in most cloning vector there is a
Kozak sequence and that's why the free GFP always has great expression, but
if you are using the pEGFP-N vector, because the MCS is in front of the
Kozak sequence, therefore your insert will have no Kozak sequence. |
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s******r
发帖数: 2876 | 4 clontech的pEGFP-N1有全序列。
我需要克隆GPF到PDONR201,请问怎么查GFP的序列阿,谢谢 |
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c*******7
发帖数: 28 | 5 在尝试用FACS区分表达EGFP／RFP的两种细胞,希望最后能统计出两者的ratio
但是奇怪的是,EGFP在FL1,FL2两个通道的分布几乎完全相同,不能区分
用的是pEGFP-C1载体,EGFP在N端,无插入序列,共聚焦显微镜下表达正常,用红色荧光通
道无法检测到
转293T cell，没有做任何固定,仅用PBS重悬
同时看了RFP或者mcherry,就可以用FL2通道检测,在FL1上信号很弱,可以区分出来
想问一下大家有没有遇到这样的情况?这是质粒本身的问题还是机器调试的问题? |
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s*********y
发帖数: 387 | 6 处理了大概30个质粒，还有30-50个需要大提，
处理的30个中，主要是pCDNA和peGFP的质粒，插入大概3k 到 8k的基因片段
部分比较好，150ml菌，能有1000ng per ul浓度，有1ml体积
部分比较的诡异，浓度只有30 ng per ul，在1ml的体积中。
但是测序的 时候 都是 对的！！！！而且浓度低的 mini prep没有任何的问题
浓度在200 ng per ul，体积在 50ul |
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e**r
发帖数: 1144 | 7 1ng 质粒转化，只长了十几个
kanamycin浓度降到1/8， 没有明显改善
competant cell应该没有问题，用氨苄抗性的质粒测试应该在 10^8左右
有人遇到过类似现象没 ？ |
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b******n
发帖数: 4225 | 9 来自clontech的pEGFP-N1的EGFP
用哪的抗体特异性高，效价也高？谢谢 |
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C**S
发帖数: 522 | 11 我最近也在装一个载体，把一个5k的基因装到pEGFP－C1载体再把GFP fusion蛋白装到
pBabe retroviral里。酶切测序都对，就是转到293T细胞里只能看到极少数细胞GFP阳
性。真的是因为基因太大了？谢谢。 |
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E*****e
发帖数: 54 | 12 就是一般的质粒如pEGFP－N1， 转到Hela或者293T里
还有一个问题是，质粒会随细胞分裂而复制吗？ 谢谢 |
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s*****i
发帖数: 315 | 13 把pegfp c1 的cmv 换了不就行了？就一步克隆，order 一个gene block 再用gibson合
成，连pcr都省了
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7 |
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w*********1
发帖数: 27 | 14 最近从别的实验室要了一个pEGFP-Tubulin质粒，转染HeLa细胞后本想拍活细胞里的微
观的，但是发现GFP信号无论在间期还是有丝分裂期看上去都是cytosolic without a
sniff of a tubule。起初怀疑是人家给我的质粒有问题，就自己找模板构建载体了，
自己构建了两个载体，一个是Tubulin-EYFP, 另一个是EYFP-Tubulin, 就是一个EYFP在
Tubulin C 端，一个在N端， 测序看读码框啥的都没问题。 但问题也来了，EYFP在
Tubulin C端的（Tubulin-EYFP）质粒表达效率特别低，虽然转染效率还可以，就是
EYFP的信号特别特别弱。 换成EYFP在Tubulin N端的（EYFP-Tubulin）质粒转染Hela之
后，效率倒是相当之后，荧光强度也超赞，但是和人家给我的质粒问题一样，都是
cytosolic without a sniff of a tubule。 请问各位老师有没有遇到相同的问题以前
？谢谢啦。 |
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v********a
发帖数: 646 | 15 两个问题请教：
1、30kb的大质粒，应该如何转染，才能达到最高的转染效率？
2、这个质粒携带的是mouse gene，但是cmv启动子来自于pEGFP-N1质粒，可以转染人细
胞株么？
谢谢！ |
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v********a
发帖数: 646 | 16 两个问题请教：
1、30kb的大质粒，应该如何转染，才能达到最高的转染效率？
2、这个质粒携带的是mouse gene，但是cmv启动子来自于pEGFP-N1质粒，可以转染人细
胞株么？
谢谢！ |
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发帖数: 1 | 17 不知道大家发现没有，HAN文章里的质粒与ADDGENE里是不一样的。
对于Supplementary Figure 4第一张图，想知道他是用的什么抗体。
因为ADDGENE 里面的NLS-NGAGO质粒是没有标签的。
而且文章里面说nls-ngago质粒的骨架是pcDNA3.1，但是ADDGENE里面的骨架是pEGFP-N1
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i***9
发帖数: 106 | 18 顶一下，有多少人知道pcDNA3.1或者pEGFP-N1等含有SV40 origin的质粒会在HEK293里
面自行扩增的？算是普及知识面。 |
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发帖数: 1 | 19 印象中大部分的载体上的CMV启动子组合都是CMV enhancer+CMV promoter，比如pEGFP-
C1载体。
最近实验室从SBI买了一个载体pCT-Tubulin-GFP，看了公司给我的map，我也测序验证
了下，看到这个载体上的启动子只有CMV promoter，没有enhancer。
这个载体使用以及基因表达完全没有问题。我就是突然好奇想向各位老师请教下这个
CMV enhancer是否是必须的？理论上CMV enhancer肯定是能增强CMV promoter的效率。
但是如果没有的话例如SBI这个载体用起来也没有啥问题，表达量也是刚刚的。哪位老
师可以给讲解下CMV enhancer的功能吗？有没有谁比较过with enhancer和without
enhancer的CMV promoter的基因表达效率? 谢谢啦！ |
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