Z******5
发帖数: 435 | 1 你这个值也太低了吧。读数大小和荧光收集时间的设置有关，我一般设置收集2秒，自
己用移液枪加液（没钱，剩），每次就测3个well的。具体：
背景值：黑板40左右，白板100左右
Firely的值从几万（转染效率低的细胞）到几千万（293T细胞）；Renilia的值从几百
到几万（我用的是pRL-TK载体做内参，转的相对较少）
你的明显有问题（当然前提是问题不是出在你用的promoter上），建议你在你用的cell
line和293细胞中同时转染pGL3 control，pGL3 Basic，和pRL-TK载体，然后测荧光值
，看看你的试剂，测试程序等有没有问题。 |
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b**********8
发帖数: 349 | 2 我跟楼主遇到过几乎完全一样的困境，不过我的克隆比你更简单，我很菜的，就是把一
个基因的启动子克隆到PGL3 basic的载体里，也是前前后后做了好几个月没结果，顶多
就是把目的片段连到TA上，可是从TA上切下来连到PGL3 basic上时始终长不出来。后来
老板发飙了，亲自动手做了一次，哇塞，成功了，跟着就被老板劈头盖脸地训了一顿，
说什么cloning is the most basic techniques in molecular biology,if you
cannot do this, you can quit this area.不过我老板还从来没有赶人的经历，顶多
就是骂骂，然后一直看你不爽。
momo楼主，和老板好好谈谈吧，或许他只是一时气话，你自己再想想办法，或者把你手
头的工作找实验室其他人帮你做做，克隆有时候就是个运气，一个人做不出来，换一个
人就能做出来，我后来还帮组里另外一个PhD做出了一个她长期搞不定的克隆，长出一
口恶气啊。 |
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m*********n
发帖数: 215 | 3 一直都用pGL3....没研究过pGL4。..4比pGL3好在哪里？ |
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l**********1
发帖数: 5204 | 4 ZZ
老外的forum 有关的讨论帖 的最精彩的一句推论:
>So if I understood well, you suggest to lengthening the 5' end of the
construct including part of the promoter in a promoterless vector and then
transfect different cell lines and see in which one the entire transcript
will be expressed.
details pls go to
htp://molecularbiology.forums.biotechniques.com/viewtopic.php?f=2&t=31288
看看能否有助LZ的这问题的解决?
有一点务必牢记: without in vivo experimental data support for a new species 5'UTR information Blast
information is just a block ... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 5 RE LZ
just go to
htp://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31627067.html
11f
一句话： 要确定某个表达蛋白(A物种) 的真正的5' UTR 范围碱基序列
最好将其包括启动子部分的碱基序列转接到一个非启动子功能的载体
然后转染到异种(B物种: 可以是A物种的近缘) 的Cell line 表达那个目标蛋白
再提取那个表达后的目标蛋白
如果后者同In vivo (A物种) 的生化物理性质完全一致,
那么其包括启动子部分的碱基序列 就是真正的5' UTR 范围碱基序列
[回复]
发信人: lotkaeuler11 (Fibonacci), 信区: Biology
标 题: Re: 急求：怎样从基因组序列中找出基因的5'UTR确切序列？
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Jan 19 05:09:42 2012, 美东)
ZZ
老外的forum 有关的讨论帖 的最精彩的一句推论:
>So if I understood well, you suggest to lengthening the 5' end of th... 阅读全帖 |
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b**********8
发帖数: 349 | 6 又来请教各位大侠了，
我最近发现对一株细胞做某种处理后，一个基因（暂命名为A）的mRNA和protein都显著
下调，结果已经重复多次。现在推测这种处理因素可能会影响细胞株中A基因的转录，
于是构建了一系列逐渐缩短的启动子报告基因（基于pGL3-basic载体）和renilla载体
一起转染细胞。双荧光素酶报告基因分析发现从转录起始位点上游1000bp处开始，一直
到上游150bp，跟对照处理相比，处理组细胞的报告基因的活性一直都有显著下降。见
图A所示。但是当把所有组的报告基因活性都先被对照组pGL3-promoter的活性
normalise后，统计分析却显示到上游200bp时报告基因的活性就没有差异了。两张
figure都是在grapad prism里面用two way anova做的统计分析，结果却截然不同，这
关系到我接下来具体分析哪一个区域的问题，请大家帮我看看，到底哪一种统计方法更
合理？谢谢 |
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p*****n
发帖数: 981 | 7 ☆─────────────────────────────────────☆
jacinta (我不做妖很久了) 于 (Wed Jan 31 11:25:54 2007) 提到:
agar plate + kana 长出了克隆后（但是这些克隆长得很奇怪，偏小，每一个周围都有
很多更小的卫星一样的点点）。挑了一些miniprep，3ml + kana，第二天没有任何细菌
长出来！LB清澈透明！
怎么回事？原来板上的那些是假阳性？我是：Insert DNA + pGL3 (already made
before)---> StuI (blunt end) + NocI (to cut some fragment of insert DNA)-->
Klenow make blunt end--> ligation (recirculation) --> transform
如果没有recirulation的话，是不会有克隆的啊。怎么会是假阳性呢？不是假阳性怎么
解释现在不长呢？
☆─────────────────────────────────────☆
mickoal |
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Z******5
发帖数: 435 | 8 去UCSC genome browser上看看，主要看聚合酶2的峰值位置，组蛋白修饰，转录因子结
合，就大概能猜到启动子位置。再结合RIKN用5'CAP方法找到的转录起始位点位置，如
果是在一起，那就非常准确了。
然后选取三四段不同长度的区域克隆到pGL3 basic载体上，看看活性就知道了。 |
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Z******5
发帖数: 435 | 9 基本都用promega的pGL3系列，但是我一直想换pGL4系列的，可惜找不到。（不想掏钱
去买） |
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b**********8
发帖数: 349 | 11 谢谢楼上各位回复。
回rosner ：突变后的序列基本上还是原来目的基因的序列，只不过突然出现了频繁的
mismatch
回Laforet：extension会影响结果吗？
回icool：质粒是一个基因的核心启动子序列连到PGL3-basic 上来的，GC含量确实很高
，70%以上。2 piece PCR 是否就是overlapping PCR？
再次感谢各位。 |
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Z******5
发帖数: 435 | 12 应该是相关的。否则那么多用pGL3 + pRL-TK的结果就没法解释了。
be
irrelev |
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g*********5
发帖数: 2533 | 13 请问split luciferase 你用的是不是 pGL3 BASIC? |
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w***r
发帖数: 709 | 15 这个人太牛X了。他在song h 甲基化文章真的很炫!！
但是我个人觉得
Cytochrome P450 drives a HIF-regulated behavioral response to reoxygenation
by C. elegans. Science (2013) Vol. 341 no. 6145 pp. 554-558. PMID: 23811225
这篇文章似乎新意不够，hif 和p450和缺氧的关系早就知道了。下面是一篇，还有不少
有明白人讲一讲吗？
Inhibition of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD)-stimulated Cyp1a1
promoter activity by hypoxic agents.
Kim JE1, Sheen YY.
Author information
Abstract
Since hypoxia-inducible factor-1alpha (HIF-1alpha) and the arylhydrocarbon
receptor (AhR) shared th... 阅读全帖 |
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w***r
发帖数: 709 | 16 这个人太牛X了。他在song h 甲基化文章真的很炫!！
但是我个人觉得
Cytochrome P450 drives a HIF-regulated behavioral response to reoxygenation
by C. elegans. Science (2013) Vol. 341 no. 6145 pp. 554-558. PMID: 23811225
这篇文章似乎新意不够，hif 和p450和缺氧的关系早就知道了。下面是一篇，还有不少
有明白人讲一讲吗？
Inhibition of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD)-stimulated Cyp1a1
promoter activity by hypoxic agents.
Kim JE1, Sheen YY.
Author information
Abstract
Since hypoxia-inducible factor-1alpha (HIF-1alpha) and the arylhydrocarbon
receptor (AhR) shared th... 阅读全帖 |
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s**********a
发帖数: 92 | 17 之前发过相关问题帖子:
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31968723.html
现在正按照大家建议扩一个3kb的promoter， 然后连接到pGL3 or 4。
我的方法：引物两端加酶切位点，外面另有三个保护碱基。
1，Q5扩片段，跑胶证明分子量对，胶回收，双酶切，连接pGL，转化，无克隆。
2，Q5扩片段，Taq加A，连接T载体，转化，无克隆。
3，Taq扩片段，连接T载体，转化，无克隆。
大家帮我分析一下，问题出在哪里。难道是一开始的引物问题么？引物会有什么问题呢？
谢谢大家！ |
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C*******4
发帖数: 400 | 18 你PGL3酶切以后有小片段出来和跑胶纯化没有？PCR引物在5端有没有留足够的碱基？有
些要3个才能有效切开。
Q5扩增很猛，可能你3K的片段在和Vector混合的比例不对。
T4LIGASE或者它的BUFFER 里的ATP没了都有可能造成转化不出克隆。
酶切点是甲基化不敏感类型吗？ |
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