d***y
发帖数: 195 | 1 也许非常简单，
可以用这个phospho的kinase的inhibitor处理细胞，然后看定位，
尽管这个未必特异且未必很简单，但最直观，
如果处理后是C，敢说100个review里有90个不会说任何废话的，
其余的10个可能建议你做个RNAi之类的，如此而已。 |
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w*e
发帖数: 740 | 4 完全可能，因为用PH3只能捕捉到很少一部分增殖的细胞（刚好在很短的M期）
而BRDU可以连续注射，注射次数越多，你标记到进入S期的细胞就越多。 |
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h******y
发帖数: 1374 | 5 CST:
Phospho-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) (D3F9) XP™ Rabbit mAb #4511
1:2000 dilution |
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x*****7
发帖数: 58 | 6 有人用过识别磷酸化得Sp1 得抗体吗，推荐几个比较不错得 |
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y******8
发帖数: 1764 | 8 Anything extracellular is a potential antigen. Pure pSer antibody in the
animal would develop autoimmune diseases.
So, the pSer antibodies on market are not agaist pure pSer, and are always
context dependent.
If you have a clear target protein, just develop a site specific antibody.
Other wise, p32 is not bad to try since majority of phospho signal comes
from pSer.
are
some
to
with
ourselves
specific |
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y******8
发帖数: 1764 | 9 For the phospho-site prediction, unless your kinase is defined, it is very
hard. Some kinase has very conserved target sequence, but others display no
pattern.
are
some
to
with
ourselves
specific |
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c**********e
发帖数: 230 | 10 想请问一下, 有没有哪位同学可以推荐一下可以买到的early mitosis marker?
phospho H3 comes up too late.
多谢了. |
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s******a
发帖数: 472 | 11 http://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765(11)00331
Fifty Years after Jacob and Monod: What Are the Unanswered Questions in Molecular Biology?
=====================================================================
Tomorrow's Molecular Biology
Marc W. Kirschner
Harvard University
Today, the term molecular biology has a rather prosaic sound. After all,
there is little in contemporary biology that isn't molecular. It's hard to
remember that 50 years ago, molecular biology was distinctly ... 阅读全帖 |
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y******8
发帖数: 1764 | 12 IP first. The pan-phospho or glyco WB. Phosphatase and deglyco as controls.
Mass Spec would be the ultimate. |
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S***a
发帖数: 257 | 13 我默认你说的NFkB是p65吧。
phospho-p65在cst上我查了一下，只有Ser468和Ser536这两个位点的磷酸化抗体。
Ser468-P的功能我不太清楚，但是Ser536-P的功能应该很多研究，而且以前我用过这个
抗体很强，我觉得3033应该不错。在Raw细胞上用LPS刺激以后15分钟到一个小时应该都
很强。
其实你要检测NFkB激活，最经典的应该是检测IkB的磷酸化和降解。
如果你都检测不到，你应该查一下你的刺激是否有效（是不是刺激源放太久坏了）或是
细胞出了什么问题 （mycoplasma污染之类的）。
good luck! |
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R****t
发帖数: 6 | 14 我以前做JNK Blot的时候 也遇过这种情况 估计是不同的isoforms |
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c**a
发帖数: 94 | 15 那为什么有些sample有,有些sample里没有呢. 而且blot for total JNK的时候就没有
那条带 |
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a*****x
发帖数: 901 | 16 Check the epitopes for ur p-jnk and jnk to see whether it's possible
cleavage |
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B****w
发帖数: 48 | 17 1个小时serum starvation时间太短了。 |
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a*******n
发帖数: 156 | 20 你确定你那个抗体对仓鼠有反应?
我印像中cell signaling的P38是单抗 |
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S****r
发帖数: 982 | 21 Taking anisomycin or UV treated CHO as positive control. There are decent
amount of p38 in CHO, but anti-pp38 from Cell Signaling may not work well to p38 from CHO. |
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k****o
发帖数: 589 | 22 一个小时starvation太短了吧，文献里各种细胞很多都是6－24小时
你total p38有信号没？ |
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w***a
发帖数: 1053 | 23 p38量很低，你可以弄个uv照一下，或者+tgf-beta做个阳性对照 |
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i*********0
发帖数: 915 | 24 I am using Phospho-Stat3 (Tyr705) (#9145) from cell signaling.
I favor the answer of small isoforms. Maybe they have different functions.
Thanks a lot, guys, for the answer. |
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i*****g
发帖数: 11893 | 25 根据我的记忆，好像是caltech Ramond D 的seminar，2008（2007年）年吧
Ub E3 ligase的数量很多很多，那时已经知道有500个之多了，可以媲美phospho
kinase 800个之多那个数量，两者均为繁复调控的手段
E1 大概12个, E2 50-80个
所以，这么多E3，可以想象是很复杂的故事 |
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l*******e
发帖数: 170 | 26 我见过一个博后十个月做了1800个蛋白的Western Blot；
还有个花了几年时间做了一万多的。
protein array很难吗？由公司在搞吗？
比transcript array有用多了吧？
另外phospho-array那个公司的产品最好？ |
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p*****p
发帖数: 19331 | 28 你需要先考虑的是,你期待这个突变会引起什么样下游反应.要是屁下游作用都没有,磷
酸化做得再漂亮都没用.
做磷酸化,最简单的就是把所有抗体买来试,不要说不可能,这是最方便的,如果可以,你
可以问他们要sample，你只要付运费。
不行就做phos-tag，不过，不向他们宣传的那么好做
最可靠的就是in vivo labeling,不是in vitro kinase assay,不过需要用同位素，很
多人都不愿意做。
pan-phospho的抗体，貌似只有p-tyr的好用，而且还必须是4G10
IP |
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l*******6
发帖数: 128 | 29 最好是提供从肽设计、合成到抗体制备、纯化全套服务的公司。请问哪家公司在质量、
价格、需要时间等方面都比较好？谢谢！ |
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l*******6
发帖数: 128 | 30 顺便请教一下：如果只是检测位点有没有发生磷酸化，多克隆的抗体可以吗？先谢谢了！
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l*******6
发帖数: 128 | 31 没有人回复啊！请做过的朋友推荐口碑不错的公司，谢谢。 |
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C**S
发帖数: 522 | 32 提供全套服务的很少吧，一般只做其中的一部分。如果最终抗体不好用，也不会怪到他
们头上。 |
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l*******6
发帖数: 128 | 33 非常感谢，我将尽快和他们联系。
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M*****2
发帖数: 379 | 34 最近需要test p38 pathway， 用了specific inhibitor SB 203580
但是居然发现在2种不同cell line里， SB 203580都明显的增加了phospho－p38，而且
做了个dose－dependent试验，单纯只加SB 203580，不但没有inhibit，反而activate
了p38。
已经试过了Cayman和 Sigma 2家的chemical，而且也serum free12h， pre－
treatment2小时过，能troubleshoot的都想过了，还是这种相反的结果，实在是想不通
怎么回事？
请教大家有过类似的问题么？ 有可能是什么原因呢？ 等着这个inhibition做最后的in
vitro试验，折腾好久了。。。 |
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s*******n
发帖数: 37 | 35 你不能用phospho P38去检测p38 inhibitor,inhibitor 结合kinase domain,和
activation domain 的磷酸化是两回事。你应该用p38底物(mapkapk1?)的磷酸化去确
定抑制剂的效果。
activate
in |
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p*****h
发帖数: 36 | 36 Serum starvation gives a lower (thus better) baseline, as serum contains
growth factors; also, your cells are generally synchronized if there is a
growth arrest with serum starvation. You can skip the starvation, and
usually you'll also see an increase in phospho-AKT, ERK1/2 etc.
You may try 0.2% FBS 0.1% FBS etc. instead of no FBS at all.
Check the literature about the concentrations used for your particular cell
lines. 10-100 nM is a good start. |
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E**********y
发帖数: 991 | 37 what about phospho-p65? |
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r******k
发帖数: 446 | 38 LZ这个方法 难道直接往loading buffer里面加 protease inhibitor和 phospho
inhibitor？ |
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y****6
发帖数: 196 | 39 搭车问个问题：市面上的ubiquitin specific antibody 好像都是可以检测任何
ubiquitin，不区别连着的蛋白。有没有识别特定蛋白＋ubiquitin 的抗体？类似于
anti-phospho-protein antibody?
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.2 |
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r******k
发帖数: 446 | 40 还想问一句，SDS loading buffer直接scrape下来的时候 是不是就不用加protease
inhibitor 还有 phospho-stop了？？谢谢 |
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r******k
发帖数: 446 | 41 小弟最近做一个蛋白的磷酸化 以为没有特异性的抗体。 只能IP total的protein 然后
用Pan-Tyr。 但是这个磷酸化总是出不来。班上有大牛说用预热的（90度以上？）SDS
loading buffer 挂下来以后直接boil再稀释10-20倍做IP。 但是有一个问题，10cm的
dish怎么也要用500ul的loading buffer scrape下来吧？ 那也无法稀释了呀？
难道先用pbs刮下来？？ 而且这个PBS是冰的把？而且还有protease inhibitor 还有
phospho-stop？ |
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e****s
发帖数: 1125 | 43 我最近也有两个从Cell signaling抗体不好.
我一直蛮喜欢Cell signaling抗体的，总体非常Reliable.
不知道怎么，最近买了两个，一个Phospho抗体对Phosphorylated over un-
phosphorylated sample的选择性几乎没有。另一个，就是没有检测到我的蛋白。
sig |
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发帖数: 1 | 44 Genome-editing
下午4:50（6 分钟前）
其他收件人： h********[email protected], c******[email protected], o*****[email protected]
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- 显示引用文字 -
hello guys,
we tried NgAgo plasmid cotransfection with 5'phospho-ssDNA guides and I must
say cell mortality rates are very high (toxic). We got 5'phospo-ssDNA
guides synthesised from IDT, desalt purification. Does anybody have tested
desalted verus PAGE purified ssOligos and looked for cell viability.
cheers! |
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m*****n
发帖数: 760 | 45 目标蛋白大概60 kd
phospho-MS显示在C端有2个aa会被磷酸化。
没有phopspho-specific抗体
现在想看看磷酸化后在SDS-PAGE胶上会不会有shift
试了不同浓度的胶(8%,10%,12%,4-20%)，都没看到shift
想请教版上的各路大牛，这种大小的蛋白磷酸化之后会shift吗？
如果会shift的话，需要什么样的条件才能detect到？ |
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m*****n
发帖数: 760 | 46 只有目标蛋白的抗体，但是没有磷酸化特异性抗体。
样品在做phospho-MS时发现了这2个位点被磷酸化，
所以就做了western来看一下蛋白磷酸化之后有没有shift。
现在的问题是这个蛋白是不是太大了，所以1-2个位点的磷酸化并不太影响mobility
此外，多谢您的建议用phos-tag gel
以前没接触过这个，有没有比较好的reference? |
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f*******d
发帖数: 92 | 47 做过很长时间激酶的人告诉你，各种试剂盒，各种抗体，除非有特异性能识别被磷酸化
为点的抗体，还是不如p32. P32测激酶活性不需要optimize，只要有，就能做出来。其
他各种各样的方法，你都要多试几次，才能知道是不是work了。还有一个就是phospho
tag胶，做起来也比较麻烦。所以劝你，还是用p32吧，防护措施做好，没关系的，省不
少麻烦。 |
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发帖数: 1 | 48 真理，其它还是花拳绣腿目前，除非你真的十分排斥p32或者没条件上
phospho |
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w***a
发帖数: 111 | 50 The Biozentrum, University of Basel, is looking for a highly motivated and
knowledgeable
Postdoctoral Research Fellow in Systems Biology: Analysis of the Host Cell
Signaling Network Controlling
Pathogen Entry into Human Cells
to join the research group of Prof. Christoph Dehio This position is part of
“InfectX”, a collaborative project
funded by SystemsX.ch – the Swiss Initiative in Systems Biology
The aim of the InfectX project is to use a systems biology approach to
decipher the host cell sig... 阅读全帖 |
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