T**********t
发帖数: 1604 | 1 我就是用的BL21(DE3)pLysS strain，用0.4mM的IPTG诱导，表达4hr，蛋白产量很好。
T7 lysozyme是T7 RNA polymerase的natural inhibitor，它的表达是为了抑制在BL21(
DE3)里比较常见的leaky expression，但是这个表达量不至于抑制被IPTG诱导后的
expression。而且lysozyme不是蛋白酶，不可能降解你的蛋白。
你的蛋白如果用BL21(DE3)表达很好，说明你的蛋白对E.coli没有细胞毒性，你可以不
需要用BL21(DE3)pLysS来表达。
还有就是你看一下你用的是BL21系列还是BL21 Gold系列，这两个系列都有(DE3)和(DE3
)pLysS，但是我用BL21 Gold系列就碰到过表达不出来的问题。我说的BL21和BL21 Gold
都是Stratagene（现在的Agilent Genomics）的产品，不知道别的公司是不是也是这么
标识的。 |
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s********n
发帖数: 2939 | 2 你是指你用的这个带有pLysS的菌株是别人engineer过的，不是commercial的？
如果是这样的话他们应该会有原始不带pLysS的菌株，问问看。
如果实在不行的话，可以试试将这个菌株在不含Cm的培养基转接几次，然后划线在不含
Cm的平板，挑取单clone再分别划线于带有Cm和不含Cm的平板，这样估计你能找到丢失
pLysS质粒的菌株。 |
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g*****y
发帖数: 6325 | 3 我的蛋白bl21(DE3)的细胞里0.5mM IPTG induction 表达很好。后来转到BL21(DE3
pLysS)里 加IPTG却不表达我试过
0.1-2mM的IPTG. 2hr, 4hr 和 o/n. 2mM IPTG O/N 好像有一点点表达。。 都是同样
的蛋白同样的hosting vector. 现
在怀疑是不是BL21(DE3 pLysS)里表达的lysozyme 把我的蛋白降解了? 不太可能啊！
大家有没有遇到类似的情况呢？ |
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s********n
发帖数: 2939 | 4 既然在BL21(DE3)表达很好的话，为什么还要试BL21(DE3)pLysS呢？有特殊原因？我的
经验是BL21(DE3)pLysS表达很多蛋白都不好。 |
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g*****y
发帖数: 6325 | 5 是的lysozyme 降解多糖的。。 不应该降解我的蛋白。 我表达好的是bl21 gold. 但是
我最后是必须用plysS这个菌株的因
为这个菌株是从别的实验室拿来的还有另一个特别的属性是我需要的。 我现在想在没
有chlor resist 的LB培养这个菌株一
段时间直到它失去plysS这个vector. 不知道可行吗?
BL21(
DE3
Gold |
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T**********t
发帖数: 1604 | 6 对，还有一个我忘了说，就是检查一下培养箱温度。
我原先用BL21-Gold的DE3 pLysS表达出现问题troubleshooting的时候，后来发现就是
培养箱温度不对，设定37度，实际到了39度。这时候用BL21的DE3 pLysS表达就没有问
题，但是BL21-Gold的菌液几乎完全被lyse掉了。所以后来虽然我把培养箱温度重新设
定好了，还是不敢再用BL21-Gold的菌株了。
induction. |
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T**********t
发帖数: 1604 | 7 有一个问题，万一你的蛋白不表达不是因为pLysS，而是因为这个另一个特别的属性呢
？如果是这样，那你就算把pLysS质粒想办法剔除了也还是一样解决不了问题啊。。。 |
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g*****y
发帖数: 6325 | 8 我最后是必须用plysS这个菌株的因
为这个菌株是从别的实验室拿来的还有另一个特别的属性是我需要的 |
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n***w
发帖数: 2405 | 9 正在做蛋白表达，用的是rosetta-gami 2 DE3 plyss, 这里各种trouble shooting，我
喜欢～ |
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g*****y
发帖数: 6325 | 10 不是不是， 是他们在novogen买了plysS的细胞然后又加了一种特性。我也是这么想的
。希望不要花太多时间。 还有你知
道那里有卖那种可以把一个板子上的colony复制到另一个板子上的那种film吗？ 我想
用这个方法可能筛选快点。 |
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j********o
发帖数: 2 | 11 Yes. Not only BL21codon plus, but almost all BL21s except BL21(DE3)pLysS/E are
leaky. pLysS/E encode enzyme that degrade T7 polymerase to avoid leaky.
In your case with many rare Arg codons, you have to use codon plus. So, it is
importment to avoid leaky? otherwise, just express with leaky if it does no
harm. |
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j********o
发帖数: 2 | 12 BL21codon+ is indeed BL21 with a plasmid that expresses rare codons and
BL21(DE3)pLysS/E is indeed BL21 with a plasmid that expresses an enzyme that
degrade T7 polymerase to avoid leaky. Both plasmid are chlorepenicol
resistance. In inder to make codon plus in BL21(DE3)pLysS/E strain, drug
marker of one plasmid must be change and the system will become too
complicated - the strain resist to two drug, plus another drug marker for your
recombinant protein.
it.
are
is
no
of |
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n***w
发帖数: 2405 | 13 Hi, all,
I am using Rosetta-Gami DE3 pLySs to expression my fusion protein which is
predicted as 91kDa.
I first did the expression assay and found protein expression was induced
after adding IPTG by testing the whole cell lysate. (bacteria at certain
time points, add 2X sample buffer, boil, SDS-PAGE).
Then I moved to culture more and lysed the cells using a sonicator, after
resuspending the pellet with 1x cold PBS/1% PI. After all these, I loaded
the supernatant and pellet side by side and stain... 阅读全帖 |
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R*s
发帖数: 2041 | 14 1. never heard of measuring bacterial at OD546 and calculating as u
said below. We only do it at OD600.
2. What temperature you grow the cells? Hope it is 37, not 30.
BL21(DE3)Plyss does grow relatively slower than other E.Coli strains.
However, it is not as slow as yours.
3. In fact, 12 hours for your transformed culture to reach OD 0.8 is not
terribly slow. It usually take us 6-9 hours to do so.
4. Last suggestion, make sure your Amp and Chl concentration is correct.
Even if they are correct, |
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f*********p
发帖数: 13 | 15 IPTG induces the expression of T7 polymerase (T7 pol is under the control of
lac, inducible by IPTG), which in turn translates your gene of interest
because it is under the control of T7 promoter and has to be processed by T7
pol, but not E.coli pol. without IPTG, T7 pol has very low basal expression
level, and your gene of interest will have some low basal expression too.
plysS expresses a low level of lysozyme, which functions as an inhibitor for
T7 pol, and thus, with no IPTG induction, inhib |
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f*********p
发帖数: 13 | 16 I do not think you fully understood my answer to your question yet. let me put
it this way.
what kind of BL21 are you using? BL21 has BL21 (DE3), (DE3) pLysS, ...
different subtypes. I assume that you are using DE3 related strains. DE3
strain has a lambda phage lysogenized in BL21 e.coli, on which there is a T7
polymerase gene under the control of lac promoter. when you grow the cells up,
no or very little T7 pol can be expressed. when you add IPTG, it induces the
expression of T7 pol, which the |
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j*****a
发帖数: 92 | 17 拿有我insert DNA的recombinant plasmid(pRSet A)去测序，１００ ％ 符合。（我的
insert有1.０ kb），transform into BL21(DE3)pLysS Competent Cells 用His柱子纯
化蛋白. SDS-PAGE显示分子量20 kDa, 应该是35 kDa. 谢谢高手们回答。 |
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j*****a
发帖数: 92 | 18 谢谢大家的分析。我的insert DNA是N-His tag。 如果是翻译提前终止或降解，有什么
方法补救吗？
背景：拿有我insert DNA的recombinant plasmid(pRSet A)去测序，１００ ％ 符合。
（我的insert有1.０ kb），transform into BL21(DE3)pLysS Competent Cells 用His
柱子纯化蛋白. SDS-PAGE显示分子量20 kDa, 应该是35 kDa. |
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T**********t
发帖数: 1604 | 19 E.coli的BL21(DE3)pLysS strain。带的质粒是个小质粒，表达的蛋白不大，只有7kD，
没有细胞毒性。用的培养基是LB+M9 salts，抗生素是Amp+Chloramphenicol。关键是以
前摇菌（同一个strain）都没有这个问题，最近屡屡出现，我不知道是哪里
contaminate了，如果是phage的话，就恐慌了，据说很难清除phage。 |
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b********c
发帖数: 161 | 20 我老板说他以前也遇到过这种情况,就是完全不表达了,原因不详,所以我们就没有继续
用plys的了. |
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g*****y
发帖数: 6325 | 23 至今挑过2个。 都没有表达。。 打算在做一次transformation试试。 |
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n*********m
发帖数: 38 | 24 You can try low Temperature. But I think Cam is necessary for the induction. |
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h*******0
发帖数: 48 | 27 我觉得很多时候不表达是因为菌种污染了
不是BL21或者菌里没有质粒
只要是含表达载体的BL21，肯定可以通过诱导表达的 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 28 I would try again with lower IPTG conc. (say, 0.4mM) and lower temperature (
say, 33C).
Also, if your protein is toxic to E.coli cells, it helps if you use the
strain BL21(DE3)pLysS. |
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T**********t
发帖数: 1604 | 29 pLysS只表达少量的Lysozyme用于抑制T7 RNA polymerase，而且表达出来的lysozyme在
胞内而不是细胞外，无法作用在细胞壁上。所以在lysis buffer里加lysozyme是必需的。
只不过我觉得lysozyme对于inclusion body本身的溶解应该没什么作用吧，它的作用估
计只是让细胞降解的更彻底，释放出更多的inclusion body而已。
of |
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s********n
发帖数: 2939 | 30 Then I moved to culture more and lysed the cells using a sonicator, after
resuspending the pellet with 1x cold PBS/1% PI. After all these, I loaded
the supernatant and pellet side by side and stained by GelCode and a bulk of
protein (I assume it was protein) was detected in the pellet part.
你有没有在supernatant中检测到你的target protein？如何检测的？WB or activity?
从你的表述你好像没有做WB。
Then I tried 1L culture and repeated the 2nd experiment. This time, I
incubated the supernatant with glutathione sepharose 4b beads an... 阅读全帖 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 31 osmotic shock取periplasmic fraction
但是带pLysS的不好用这个protocol
会不会leak是case by case
另外跟induce强度及时间长短有关
pelB signal peptide不一定好用
好不好用也是case by case |
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e******e
发帖数: 2 | 32 tranform recombinant plasmid in BL21(DE3)pLysS Competent Cells, observed
colonies in Petri dish culture, 10 mL cuture was good. cells stopped growing
when we put them into 1 liter LB broth. 细胞不长了，请问怎么办？ |
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L*****t
发帖数: 56 | 34 wolfson.huji.ac.il/expression/local/bacteria/studierautoinduced.pdf
附上Studier原文的链接，这篇文章推荐大家都看看，就算不是做原核表达的也有很多
有用的信息：
1. bla蛋白导致amp失效的问题，这个之前说过了。
2. Kan抗性在高磷酸盐条件下不能用来做筛选，除非把卡那霉素用量增加2-4倍
3. 限制摇瓶生长密度的主要是镁离子和供氧
如果问题集中出现在个别construct上的话还有一种可能就是蛋白毒性很强，超微量的
表达都有可能导致溶菌。（有没有原核Promoter不是决定性因素，pLysS里面的T7溶菌
酶方向反了，但是正好能提供稳定微量表达不到致死量的蛋白） |
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