i*********0
发帖数: 915 | 1 用了cmv和cag promotor的载体,GFP empty vector 表达还可以,不过GFP-fusion gene
就不行了,挑单克隆以后看不到荧光信号了,做WB检测fusion protein量也很低.
有没有更强一点的promotor? |
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s******s
发帖数: 13035 | 2 一个我做gfp reporter的endogenous promotor太弱了，有什么办法
enhance一下吗？比如类似uas-gal4的系统加一层转录调控放大？
因为要看live cell, 所以不能用gfp-antibody |
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i*********0
发帖数: 915 | 3 some promotor choice suggestions? |
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i*********0
发帖数: 915 | 4 最近听报告，一个大牛说，c-myc的mRNA调控是一个graveyrard，特别是promotor调控
这一块。这个oncogene算是做的很多了吧，为啥这在表达调控一块还是解释的不多？
希望懂行的来科普一下。
谢谢！ |
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D*a
发帖数: 6830 | 5 不知道你说的partial KO是指什么，大多数时候用cre就是为了partial KO，这个
partial是specific的patial，比如只在特定器官，或者某种特定细胞中造成KO而不涉
及其他细胞，这样就避免了用total KO或者用全身+/-的老鼠，分析实验结果时不能确
定是整体影响，还是特定细胞的特定功能。
但有的partial KO是我们不希望的，比如利用脂肪细胞中的特定promotor建立了一个脂
肪细胞中表达的cre，然后每个器官分别摘出来验证时，发现在肝中也有KO，这就是cre
是leaky的，这个当初做老鼠时很难避免，因为你也不知道你的promotor是不是多用了
一块或者少用了一块，或者旁边一个调控元件根本就是未知的，再加上后面接的又是别
的蛋白，很难预测promotor的行为，比如到底在哪里表达，什么时候表达等等。这时候
paper发表前和发表后就很容易被人critique，不过也不是不能发到好杂志上，这个原
因就不分析了哈。。。但是结果其实有可能是leaky的那部分cre造成的，而跟你本来想
KO的那个器官没有关系。。。
我现在看的一篇nature文章，我 |
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s******r
发帖数: 2876 | 6 哪一篇？说来学习学习。
不知道你说的partial KO是指什么，大多数时候用cre就是为了partial KO，这个
partial是specific的patial，比如只在特定器官，或者某种特定细胞中造成KO而不涉
及其他细胞，这样就避免了用total KO或者用全身+/-的老鼠，分析实验结果时不能确
定是整体影响，还是特定细胞的特定功能。
但有的partial KO是我们不希望的，比如利用脂肪细胞中的特定promotor建立了一个脂
肪细胞中表达的cre，然后每个器官分别摘出来验证时，发现在肝中也有KO，这就是cre
是leaky的，这个当初做老鼠时很难避免，因为你也不知道你的promotor是不是多用了
一块或者少用了一块，或者旁边一个调控元件根本就是未知的，再加上后面接的又是别
的蛋白，很难预测promotor的行为，比如到底在哪里表达，什么时候表达等等。这时候
paper发表前和发表后就很容易被人critique，不过也不是不能发到好杂志上，这个原
因就不分析了哈。。。但是结果其实有可能是leaky的那部分cre造成的，而跟你本来想
KO的那个器官没有关系。。。
我现在看 |
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u*********1
发帖数: 2518 | 7 sequencing: 更多的sequence 新方法，还有intron, promoter sequencing, levi
的TERT promoter是不是要引起一阵promoter and intron region sequencing的热潮
关于melanoma promotor mutation的文章，不知道大家有何评价？
70%的sporadic melanoma都有promotor区域的SNP，这也太surprising了
一般我们就是找coding region的SNP，或者noncoding区域的CNV/SV；没想到小小的
promotor的SNP竟然会成为背后杀手。
同样的，对于其他的神经疾病的genetics，会不会也是noncoding region的很多问题呢
？真是越来越难做了。从SNP到SV/CNV到complex region，从coding到noncoding
levi |
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l*****k
发帖数: 587 | 8 I think the priority of your question is to ask:
only the MMP promotor activity got affected?
if yes, this drug is specific to this (kind of) promotor
else this drug has general effect on
switch(case)
case 1: it affects transcription
case 2: it affects translation.
case 3: it affect protein exportation
case 4:............
qutitative RT pcr might answer some of your question, if you do Western and
find prot |
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s******s
发帖数: 13035 | 9 找 knockout line, conditional和non-conditional是啥意思啊？
一个是啥Knockout-First - Reporter Tagged Insertion (Promotor Driven Cassette
)，
另一个是Targeted Non-Conditional (Promotor Driven Cassette)
我不是做老鼠的，请问大侠们这两个有啥区别，做老鼠用哪个好？ |
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s******s
发帖数: 13035 | 10 we use invitrogen lentiviral gateway. We modified the system to be able
to insert promotor, gene to be expressed, and a tag at the same time. It's
super convinient if you do routinely express different genes (with different
tags) with different promotors at the same time. However, our system is
not published, and has come commercial complications. I guess it won't be
very difficult to set up a similar system in the lab, if you really want to
use lentivirus that much. |
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s****u
发帖数: 483 | 11 14k should be no problem for transfection using lipo2000. no expression?
promoter promotor promotor... |
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发帖数: 1 | 12 我手里用的是韩老师送来的NgAgo DNA (N).
1。 我们设计了CAS9-gRNA plasmid (C) & Podicin promotor-GFP plasmid (P) using
lipo-fectamine 2000 co-transfection into podocyte. Podicin is only
specifically and weakly expressed in podocyte.当然，我们也加了neomycin选择.
按照设计思想，只有Podicin promotor-GFP 正确编辑插入，才可以看见绿色。我们确
实可以看见微弱绿色荧光。基本吻合设计思路。
2。然后我把 NgAgo&gDNA & (P) using co-transfection into podocyte.
我们也可以看见微弱的绿色。
请问， 下一步应该怎么验证？请详细说明。不要乱喷。我是做实验。
希望可以有所发现
非常感谢！ |
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K****n
发帖数: 4 | 13 各位大牛，如果我想表达pri-miRNA with GFP, 我可以直接在GFP下游连接pri－miRNA
sequence吗？这样会影响下游的polyA seq吗？可以共享一个promotor （CMV）吗？还
是最好用两个promotor？需要用U6 drive pri-miRNA吗？不知道U6和CMV比，哪个更适
合？ |
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发帖数: 1 | 14 别的坛子网友的回答，四个人都承担了巨大的风险
1. 福林将军 －－ 引蛇出洞 ， 当了小白鼠。－－sting
2. DOJ纪检委主任（OIG）Michael Horowitz －－收网捉鱼。－－recorder
3. NSA局长 Mike Rogers －－ 送了鸡毛信。－－backup
4. 国会情报委员会主席 Devin Nunes －－ 开刀问斩。－－promotor |
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m**********o
发帖数: 2272 | 15 Our company, GlobalMarket, is the world’s leading trade promotor for
manufacturing industry. Every year we assist excellent Chinese manufactures
in attending 80 specialized exhibitions around the world. Please visit our
website www.globalmarket.com for details.
When we attend the trade shows, we would like to invite some outstanding
local students to work with us as Exhibition Ambassadors. Your
responsibility is to introduce the information of Chinese premium
manufacturers and products to buyers |
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l*h
发帖数: 4124 | 16 i did a quick online search and didn't find any good patient education
material in Chinese (simplified or traditional) on this, except for one
sentence:
多發性膠質母細胞瘤內MGMT的promotor若被甲基化，則以Temozolomide治療的效果更佳
。 |
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y****i
发帖数: 12114 | 17 Andrew Carnegie
Andrew Melon
Rachele Carson (author of Silent Spring)
Jonas Salk (inventor of polio vaccine)
George Westinghouse (promotor of AC )
张远 |
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y****i
发帖数: 12114 | 18 Andrew Carnegie
Andrew Melon
Rachele Carson (author of Silent Spring)
Jonas Salk (inventor of polio vaccine)
George Westinghouse (promotor of AC )
张远 |
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y****t
发帖数: 10233 | 19 look at apple, the one of the biggest cap n trade promotors, causing energy
price in california so high.
where it opened up its own data center?
dont give me the shit, i dont buy it. |
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y****t
发帖数: 10233 | 20 lopt,睁大你的眼睛好好看看.
挑逗一下,果然就咬.
发信人: yourtt (rainmaker), 信区: SanFrancisco
标 题: Re: 股狗大规模裁人，不可避免。
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Apr 16 18:22:03 2011, 美东)
look at apple, the one of the biggest cap n trade promotors, causing energy
price in california so high.
where it opened up its own data center?
dont give me the shit, i dont buy it. |
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c****n
发帖数: 21367 | 21 NSAID都是性寒的，嘿嘿，其实绝大部分西药都是性寒的
从它们的作用原理就能看出来啊。西药里inhibitor药多吧，
没见过多少机理是promotor的药吧？
话说西医要拿到中医体系里分类啊，大概要归入“温病派”一脉，
实际上西医也确实是对传染病，急性感染方面有特效。
但是你光知道药物性寒，意义也不是很大的说。低维模型误差很大，
还是要靠临床反复实验来矫正。哪个药的效果是多少，对什么样的人体效果会如何，
都需要仔细考量。 |
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n********k
发帖数: 2818 | 23 promotor silencing is more common than what people might appreciate, it is
very common for one to have
resistent clones but without overexpression, in ur case would be shRNA, so u
would have to do western/rt-
pcr to check it out, as well, it is rare to keep viral infected cells as
stable line because it is widely
recoginzed/believed that the expression goes down dramatically after a
couple of passages...the same goes
with tranfected cells...so the rule of thumb in general is to not to use
them a |
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h***a
发帖数: 145 | 25 please post your question in detail. |
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a*********7
发帖数: 342 | 27 if you use lentivirus to transduce the cells and you see GFP expression,
your target gene should get integrated in the cellular genome. As others
said, maybe the promotor gets modified in the cell so that the target gene
can not be expressed well. |
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S**********e
发帖数: 1789 | 28 看了这个教授的主页，竟然公布了自己review的文章，题目，杂志名称都有，是不是违反职业道德呢？
Editorial Activities
Journal Peer Reviewer
2009 International Journal of Cancer. (Article) E-cadgerin
transcriptional down-regulation by epigenetic and microRNA-200 family
alterations is related to mesenchymal and drug-resistant phenotypes in human
breast cancer cells, IJC-09-1835.
2009 Molecular Cancer Therapeutics. (Article) Role of reactive oxygen
species in the ability of H-Ras to enhance cell death induced by histone
deacetylase inhibit... 阅读全帖 |
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s******s
发帖数: 13035 | 29 俺不是做这行的，谁给我科普一下，primer extension能
侧到RNA起始，为啥就不见得是promotor
， |
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s******s
发帖数: 13035 | 30 但是lz是第一个promotor不知真假，不可能是第二个的transcript
剪切过吧？或者你的意思是上游其他基因的transcript？ |
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s******s
发帖数: 13035 | 31 一般promotor先做，序列短点（200－400bp），长的不好批。
35－40cycle, 68C延伸，尽量用好酶，比如plantium hifi taq
区？ |
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j******i
发帖数: 939 | 32 Thank you for comments! I do have CMV promotor before my gene and the
construct will be used to express in mammalian cell line. Yes, you guys are
right. Without Kozak sequence, it looks like all depends on lucky to get
high expression. To be safe, I'd better add it back to my constructs. It's
painful and a lesson I learned--to be more careful before I start an exp. |
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m*********n
发帖数: 56 | 33 都是Pol III promotor，但是H1比U6表达弱 |
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s******s
发帖数: 13035 | 34 最近在做了一个myoG promotor的GFP在老鼠细胞里面表达，
但是荧光很弱，所以打算做一个增强的系统，比如myoG-Gal4;
UAS-GFP一类的东西。请问有没有现成的系统别人做过的？如
果自己做，有哪些类似UAS/Gal4的敏感的转录增强方法 |
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y***i
发帖数: 11639 | 35 最好在同一层加大信号，比如用更亮的gfp，或者两个gfp甚至3个gfp连在一起，或者
用luciferase。加一层放大误差太大了。 |
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A****9
发帖数: 262 | 37 你的promoter受什么调控就用什么刺激一下试试看 |
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s******s
发帖数: 13035 | 38 嗯。不过有没有更亮的方法。我其实用的dsred或者dtomato |
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b*******e
发帖数: 30 | 39
add T7 system to amplify signal? |
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d***y
发帖数: 8536 | 40 查查文献，看看有没有强的promoter，然后把那个肉的promoter置换出来。 |
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w*******d
发帖数: 396 | 41 Could you add an enhancer? |
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D*a
发帖数: 6830 | 42 我们也是想targeted，现在有目标基因，不想搞gwas那种。我们打算连intron和promotor都测啊。
我今天下午找了几篇测rna的给老板看，我老板还说，我不想只测rna啊。晕。
关键是我们不是测病人的实验室，所以很多东西都要从头弄。他现在想的是让一个人跟
他弄出project来，该学的东西学了，需要帮忙就看看能不能弄钱来招个tech之类的。
如果要手工测，我肯定是不干，我没有动力去揽这个活呀，呵呵。再说我也没有空。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 43 先弄钱吧。有了钱，我觉得最简单的就是让agilent做probe，找个
公司或者合作实验室NGS，你统筹一下就行了，最省力
promotor都测啊。 |
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w*****t
发帖数: 49 | 44 钱主要有3方面：
sample prepare,
run,
post-run analysis.
大家谈钱总是说run要多少钱，
实际上通常sample prepare，和post run analysis更花钱。
sample的获取，mrna的纯化，library的built，都是大把大把的money。
post-run analysis你看看research biostatistician的工资就明白了。
你要是啥都自己弄我就不说啥了，
但是你要是想publish top journal，
你没有biostatistician backup是没戏的。
promotor都测啊。 |
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a*********n
发帖数: 2526 | 45 如果是强promotor， 表达oncogen， 打死我也不做 |
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c****n
发帖数: 21367 | 46 【 以下文字转载自 WaterWorld 讨论区 】
发信人: cocoon (虫♂吃素吃米吃肉), 信区: WaterWorld
标 题: Re: 芦荟治烫伤算是中医吗
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Sep 16 16:35:35 2011, 美东)
NSAIDs都是性寒的，嘿嘿，其实绝大部分西药都是性寒的
从它们的作用原理就能看出来啊。西药里inhibitor药多吧，
没见过多少机理是promotor的药吧？:)
话说西医要拿到中医体系里分类啊，大概要归入“温病派”一脉，
实际上西医也确实是对传染病，急性感染方面有特效。
但是你光知道药物性寒，意义也不是很大的说。低维模型误差很大，
还是要靠临床反复实验来矫正。哪个药的效果是多少，对什么样的人体效果会如何，
都需要仔细考量。 |
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s*******g
发帖数: 5 | 47 想设计引物检测这些区域，但不知道怎么查这些区域的DNA序列，哪位高人指点一下，
谢过了先。
补充一下，我是做果蝇的 |
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r***e
发帖数: 2539 | 48 CMV会被silence，ef1alpha比较流行。
gene |
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i*********0
发帖数: 915 | 50 用embryoid body做了一批实验,先在ES细胞里面转了一些gene, 是cmv的vector, G418
的seletion,然后挑克隆,虽然没有看到GFP的信号,但是我还是冒险试了一下EB的培养,
结果发现EB的表型和预期的一样,但是用WB检测的时候,看不到融合蛋白的表达.老板看
了不是很相信,非要做出wb,检测到蛋白,才能说明gene 的功能和你的EB表型的关系.我
搞的那个很郁闷呀, 构建, 转了8个gene呀,3个多月的工作呀,伤不起呀.
要是能检测到蛋白,这个project都差不多可以close了. |
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