i*****9
发帖数: 133 | 1 I made protoplast from Aspergillus terreus before. When we moved to other
building, I couldn't make it work. I already struggle for 3 months. There is
no any progress. Does anyone have experience?
Thanks a lot! |
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m*******n
发帖数: 5103 | 2 此法案又称 GMO Labeling，于去年提出，在搜集足够签名后由州务卿咨请州议会表决
，但州议会并未进行讨论与表决。根据法律规定，未讨论的法案在第二年的普选时交由
选民公投，也就是今年的 11/5。如果通过，将在 7/1/2015 实施。
法案要求所有经过基因改造的食品，或者含有基因改造成分的食品，都必须明确标示。
正方认为这是民众知的权利，反方认为这会提高食品价格，尤其对本州的中小企业不利。
敬请有投票权的同学们关注此案，正反双方的意见请自行参考以下网站：
正方（主张必须标识）网站 http://yeson522.com/
反方（反对标识）网站 http://factsabout522.com/
阴谋论者可能会觉得反方一定是邪恶势力，但反方除了大公司以外，也包括本地
的中小企业。反对的原因除了提高成本，伤害本地经济以外，也有人说此法案本身不够
健全，如果实施，反而抓小放大，误导消费者。
重点是：天下事情没那么简单 --- 邪恶势力 vs. 屁民，正反双方的意见都有他们的道
理。建议同学们学习学习再决定。
此法案只是说基因改造的食品必须标识。至于基因改造的食品对人究竟有害无害，不是... 阅读全帖 |
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c********b
发帖数: 363 | 3 我觉得知道表型还好说一些,现有的信息什么都说明不了,因为ER影响的东西太多了.
maize的话应该有KO line吧,不过就怕遗传背景不纯.
ER上的蛋白,怎么也该做做细胞学实验吧,就像你前面提到的,看看seretion之类.最关键
的key experiment估计还是得根据表型来设计.
你在尝试protoplast?推荐这个protocol,成功率超级高,而且非常简单.
Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation
method |
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n****k
发帖数: 516 | 4 我觉得以前被攻击主要是genetics不能很好的重复protoplast的data，因为整株植物受
到的影响更多，俺还是认可用简单的体系先解释某个现象的一部分机理，大家都知道
kinase影响的太广太复杂了。这次有点不一样，攻击她和fred的组也是用的protoplast
做的。似乎这次集中在实验的具体条件上？比如没用他们最具活性的peptide和binding
PH？ |
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w********2
发帖数: 632 | 5 Gene transfer refers to the movement of genes within or between individual
organisms. HGT is often used to refer to all forms of gene transfer that do
not involve parent- to-offspring transfer (sexual or asexual). It can occur
ei- ther naturally or by human intervention (e.g. gene tech- nology, embryo
rescue, in vitro fertilization, protoplast fusion, self-cloning). In some
cases, HGT may be tran- sient, and not perpetuated in the offspring. Each
form of HGT comes with different considerations o... 阅读全帖 |
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f**********7
发帖数: 1139 | 6 Title: A Novel investigation in protoplast isolation and regeneration from
Ascosphaera apis: A chalkbrood disease causative agent in Honeybees
感兴趣的请把姓名，学校的邮箱，学校名称，研究方向，发给我。
只是推荐，不能保证能选上，谢谢 |
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r******y
发帖数: 21907 | 7 这个激素问题很麻烦，从表型看貌似跟谁都没关系，关键是并不太影响生长，没有形态
学上的异常。查了genvestigator了，比较混乱。。。对了，你的protoplast咋样了？
我也要开始做BiFC了。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 8 Please go to
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2518226/
>Overall, our results suggest that PUB22 and PUB23 coordinately control a
drought signaling pathway by ubiquitinating cytosolic RPN12a in Arabidopsis.
Subcellular Localization
The sGFP cDNA clone was fused in-frame to the 59 end of the full-length
PUB22 and PUB23 coding region and ligated into the pBI221 transient
expression vector. The sGFP-PUB22 and sGFP-PUB23 fusion constructs
were transformed into protoplasts prepared from wild-typ... 阅读全帖 |
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c********b
发帖数: 363 | 9 其实我觉得不一定是linker的问题，表达量出问题的可能性更大。
你是做的转基因还是transient 表达？一般我都是先在烟草里面agro-infiltrate试过
之后才做转基因，protoplast也OK，但是麻烦些。
我不同的蛋白连同样的linker（比如说pK7FGW2.0里面的那个GFP linker），表达量相
差10-50被是很经常的事情。有的用35S promoter表达好，有的用inducible （
estrogen）表达好。加不加RNA silencing suppressor差别也很大。有的蛋白老叶子新
叶子都能表达，有的只能在新叶子上表达。
与其在linker上折腾（估计也很难找到万能的），你试试agro-infiltration，用P19做
co-infiltration，这个算是做简单的了。 |
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c********b
发帖数: 363 | 10 其实看看Shen的protoplast protocol的FAQ基本上就可以了解她了。
前面提到的牛人我见过2位，Deng感觉很大气，很有一种社会责任感，入世的感觉，成
就当然不用多说，没有NAS只能是说领域内早年已经有不少巨头了。我邀请过Dong来报
告，给人很亲切的感觉，aggressive没觉得，领域内成果斐然，她学生可能没Deng那么
多，但是在ＵBC的Li Xin（我也见过，非常nice）在领域内发展的也很好，可见学生培
养上Dong也是很下功夫的。
其实你的想法很对，只要自己系统见好了，有机会才好把握。小RNA出来那一拨，
Caltech那位手下的all star们都赶上，做polymerase的Craig Pikarrd赶上了，做病毒
的James Carrington赶上了。这些都是实验室技术成熟的，机会来了，很快就发达了。 |
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d******u
发帖数: 99 | 11 楼主写的前三位都见过，对他们领域也比较了解。xw，jk早年做forward genetics相当
成功，即便在当今，也很少能见到自己实验室通过筛突变体，能把一整条全新的
pathway都给找出来。xw的cop9 signalsome 通过生化纯化复合体，最后发现每一个亚
基都是之前筛选出来的突变体; jk的sos3-sos2-sos1 一条perfect的盐胁迫通路。两人
近年来都涉足小rna和dna methylation都做得非常好。再说xn对NPR1的工作那也是非常
出色，从NPR1到下游转录因子，在整个水杨酸领域贡献都很大。相比较下jen sheen的
工作全部依靠protoplast，genetics做得不好，data 不够solid，所以影响力自然就小
。 |
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c********b
发帖数: 363 | 12 其实看看Shen的protoplast protocol的FAQ基本上就可以了解她了。
前面提到的牛人我见过2位，Deng感觉很大气，很有一种社会责任感，入世的感觉，成
就当然不用多说，没有NAS只能是说领域内早年已经有不少巨头了。我邀请过Dong来报
告，给人很亲切的感觉，aggressive没觉得，领域内成果斐然，她学生可能没Deng那么
多，但是在ＵBC的Li Xin（我也见过，非常nice）在领域内发展的也很好，可见学生培
养上Dong也是很下功夫的。
其实你的想法很对，只要自己系统见好了，有机会才好把握。小RNA出来那一拨，
Caltech那位手下的all star们都赶上，做polymerase的Craig Pikarrd赶上了，做病毒
的James Carrington赶上了。这些都是实验室技术成熟的，机会来了，很快就发达了。 |
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d******u
发帖数: 99 | 13 楼主写的前三位都见过，对他们领域也比较了解。xw，jk早年做forward genetics相当
成功，即便在当今，也很少能见到自己实验室通过筛突变体，能把一整条全新的
pathway都给找出来。xw的cop9 signalsome 通过生化纯化复合体，最后发现每一个亚
基都是之前筛选出来的突变体; jk的sos3-sos2-sos1 一条perfect的盐胁迫通路。两人
近年来都涉足小rna和dna methylation都做得非常好。再说xn对NPR1的工作那也是非常
出色，从NPR1到下游转录因子，在整个水杨酸领域贡献都很大。相比较下jen sheen的
工作全部依靠protoplast，genetics做得不好，data 不够solid，所以影响力自然就小
。 |
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d******u
发帖数: 99 | 14 Jen Sheen被攻击不是第一次了，用protoplast发了一堆nature，但是是否靠谱就难说
了。 |
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d******u
发帖数: 99 | 15 这次直接说他们的CLV合成多肽有FLS2 contamination，所以看到CLV与FLS2受体的结合
protoplast
binding |
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b******s
发帖数: 1089 | 16 Kit好用，但是很贵。一个盒子里没几个柱子。
我要做BIFC，有很多组合，需要提很多plasmids。想自己提纯。网上搜了一些protocol
，基本上都是盐沉淀之后酚氯仿纯化。试过发现转染效率都极低。我用的系统是植物的
protoplasts，有实验室用CsCL离心效果很好。想问问有没有更清洁安全的protocol？
谢谢 |
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b******s
发帖数: 1089 | 17 我以前也看到过。他们只用2ml的mini-prep，最后几个ul elute，然后做protoplasts
的转染，文章里说有70%的转染率。不知道你有没有试过？转染效率是否有这么高？我
要做BIFC，需要相对高的转染效率。谢谢 |
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J****n
发帖数: 156 | 18 我scale up他们的protocol for 100 ml菌液。work得很好，也很容易。
protoplasts |
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g***j
发帖数: 40861 | 19 Mol Gen Genet. 1979 Jan 5;168(1):111-5.
High frequency transformation of Bacillus subtilis protoplasts by plasmid
DNA.
Chang S, Cohen SN.
S*****[email protected]
大谢！ |
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i*****9
发帖数: 133 | 20 I am trying to transform Lypomyces, which is one kind of yeast. However, I
tried all kinds of methods, LiAc, protoplasting, electroporation and all
failed. Does anyone has transformation experience on this strain and any
trick on difficult transformation? Thanks a lot! |
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m**z
发帖数: 787 | 21 possible. try wash the cell with some chelator before lysis. or even make a
protoplast. |
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g*********5
发帖数: 2533 | 22 Isolation of nuclei for the co-IP and whole ChIP protocols is based on the
methods of Gendrel et al. (2002, 2005), Johnson et al. (2002), and Nelson et
al. (2006).
METHOD
For extraction and co-IP of nuclear proteins, see Steps 1-39 (Fig. 1). For
the ChIP procedure, see Steps 40-69 (Fig. 2).
Figure 1.
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Figure 1.
Flowchart for the timeline and organization for co-IP of nuclear proteins
from Arabidopsis seedlings.
Figure 2.
View larger versio... 阅读全帖 |
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C****n
发帖数: 79 | 23 看到很多大虾在谈论CRISPR，屡试不爽。这里就贴个negative 的case,请教各位专家有
没有什么好的建议。
background:
想在一个fungus里用CRISPR系统，非model system。
在该fungus中还没发现homologous recombination，so till now gene-knock-out is
not accessible.
current status:
1) Cas9 gets expressed by using GFP fused Cas9。
2)NLS works，在hyphae 中观察到 nuclear localization of GFP fused Cas9 and
NLS。 没有做western blot，因为GFP fuse 在Cas9 的 C末端，NLS 在Cas9的N末端，
这样理论上可以validate Cas9 能表达吧
2)U6 promoter，是个问题，由于该物种中U6 没有define，PCR克隆的U6 promoter不
work。根据之前大虾的建议，用了Pol II，一个version是直接... 阅读全帖 |
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C****n
发帖数: 79 | 24 谢谢，是的，至少是TALEN也试过了，不work either.
打算mutate的基因不是一个essential的基因。
目前的strategy是based on transient expression.我的载体是带resistance maker的
，如果你熟悉Arabidopsis mesophyll protoplasts transfection 的话，目前就做完
转化后,add antibiotics to enrich positive transformants 然后就直接PCR-RE
cleavage.
另外您提供的这篇paper 很有意思. 谢谢。
replacement |
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C****n
发帖数: 79 | 25 恩，谢谢，我也注意到了Hoechst这个dye了，正在计划中。
可能是各种细胞膜的通透性不一样，所以DAPI浓度有区别，有些需要很高。 我用的
DAPI浓度倒是不大（0.2ug/ml）。我试过植物protoplast，这个只有细胞膜的植物细胞
通透性很差，DAPI基本上进不去。所以我对Wiki的理解是对于某些细胞也许需要很高的
DAPI浓度。 |
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