z******5
发帖数: 30 | 1 总是问很弱智的问题，希望各位大牛包涵。
pLVX-puro可以用psPAX2和pMD2.G包装吗？ |
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z******5
发帖数: 30 | 2 psPAX2可以替代pCMVR 8.74用来包装病毒吗 ？
请大牛指点。
顺便问下H1299细胞做转染容易吗？ |
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m**********d
发帖数: 137 | 3 看addgene上有psPAX2与PAX2两个质粒，size不同，但不太明白有啥区别 |
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p****y
发帖数: 95 | 4 PEI Transfection
Transfection:
1. Split 293T cells one day before transfection in DMEM/10% FBS medium:
a. 6 well dish: 0.5x106 cells
b. 10cm dish: 4.0x106 cells
c. 15cm dish: 9.0x106 cells
2. Prior to transfection bring all reagents to room temperature.
3. In a sterile tube dilute total plasmid DNA (ug) in serum-free DMEM w/o
phenol red (volume of media is 10% of final volume in culture vessel). Use
transgene: viral packaging (psPAX2):viral envelope (pMD2G) constructs at 4:2
a.... 阅读全帖 |
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n******u
发帖数: 418 | 5 whats the package plasmids for this vector?
Could I use pMD2.G and pSPAX2? |
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i*****i
发帖数: 154 | 6 二代和三代的差别，在packaging system上，由二代的Gag/pol/Rev + VSVG，变成了
Gag/pol+Rev+VSVG，两质粒变成三质粒。病毒的编码区的进一步分割，分离，可以降低
重组野生病毒（有自主复制和感染能力）的可能性。
比较典型的二代是pspax2+pMD2.G 以及pcmv dvpr 8.2+pCMV VSVG。
而比较典型的三代是pMDLg/pRRE+pRSV-Rev+pMD2.G, 以及Invitrogen的包装系统，都是
三代。
其实clontech的包装系统应该是第四代了，虽然这个系统采用了旧的驱动系统，但是对
整个病毒蛋白的编码区做了进一步的split，并引入了tet调控，所以，应该是更安全一
些。但是共转染7个质粒的效率，显然不如三个。所以，第二代系统仍然是titer最高的
最有效的系统。 |
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s**********a
发帖数: 92 | 9 感染 human 细胞，一般 cotransfect pVSVg和psPAX2，请问感染 mouse 细胞，
transfect 293T时，还用 cotransfect pVSVg 吗？谢谢！ |
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m********2
发帖数: 317 | 10 Nat Biotechnol. 2014 Sep;32(9):941-6. doi: 10.1038/nbt.2951. Epub 2014 Jun
22.
Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic
lesions using CRISPR-Cas9 genome editing.
给通讯作者写信问了，然后第一作者的回复是这样的:
for the original virus we have been using standard calcium phosphate
transfection wit plasmid ratios of 6:10:1.5 (all ug per 10 cm dish) for
vector:psPAX2:pMD2.G.
The virus was collected at around 24-28h and 36-40h post transfection and
concentrated 50-100x with ultrazentrifuga... 阅读全帖 |
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V******t
发帖数: 444 | 11 只用两个包装的呢？
pMD2.G psPAX2
或者
pCMV-dR8.2 dvpr＋pCMV VSVG |
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E*********4
发帖数: 16 | 12 知道本版的牛人非常多，全部大隐隐于市。希望各位大神能帮忙指出mammalian Hela
lentivirus expression的问题。我们试图把一个蛋白从pCMV2-N terminal-Flag
vector上面subclone到另一个lentivirus vector上，然后在Hela里面建立over-
expression stable cell line。用的是psPAX2 and pMD2G在293T里面包装病毒（在
293T里面可以检测到蛋白表达）。问题是empty vector很顺利，但是我们的蛋白没有办
法产生病毒，或者说产生的病毒没有办法感染Hela细胞。我尝试过三种不同的
lentivirus expression vectors，同样的结果。后来怀疑是不是我的蛋白对细胞有毒
性，于是又尝试了另外一个安全无害的蛋白，还是同样的结果。现在我怀疑是不是在做
subcloning的时候，缺了或者多了什么部件？插入的位点是在multiple cloning sites
. 我的insert只包括N Flag-Protein of interest，没有polyA ta... 阅读全帖 |
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v********e
发帖数: 1597 | 13 这种情况十有八九你包病毒出了问题，建议换一个系统看看，我们通常用的是plenti_
GFP GFP可以用其他基因替换，然后跟pCMV-VSV-G 和pSpAX2包装，从来没遇到过问题，
你可以试试 |
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