j******1 发帖数: 1315 | 1 谢谢dsamyu的回复,您用过pTripz了吗?如果可以的话,它们网站上说的其实是pTripz
(和2nd match)和3rd不match.太狡猾了。 |
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m**********d 发帖数: 137 | 2 用pTRIPZ lentivirus建立起来的细胞系,稳定表达某doxycycline-inducible shRNA。
在in vitro测试phenotype很稳定
现在要把细胞在tet-off的状态打到裸鼠体内,等tumor长起来,再开始给doxycycline
以及相应的treatment。现在的问题是,doxy该怎么给,文献上很多都用doxycycline
drinking water,可我听说doxycycline可能会precipitate,很难控制老鼠喝进去的量
;还有人用doxycycline的食物,但似乎也不大好控制doxy的量。
不知是否有人用过oral gavage,似乎这样可以准确地定量doxy,隔天通过gavage给
doxy不知是否可行?
请问版哪位曾在in vivo试过pTRIPZ这个系统,它的doxy-inducible knockdown
efficiency和leakiness不知道还不好
谢谢 |
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T**********r 发帖数: 287 | 3
inducible
多谢提醒,不过你提到这个是openbiosystem的另外一个系统TRIPZ,的确是用
tetracyline
induce的。
Open biosystem有两种shRNAmir系统实现knock down:
a.Stable knockdown: GIPZ;shRNAmir is constitutively expressed as a
polycistronicvector that codes for tGFP, puromycin resistance
marker (Puror) and the shRNAmir.
b.Regulated knockdown: pTRIPZ,也是你提到的。
见链接
http://www.openbiosystems.com/collateral/rnai/pi/Lentiviral%20shRNAmir%2
0for%20Stable%20and%20Regulatable%20RNAi.pdf
再次真诚感谢,有了质疑,才能避免将来实验走弯路。 |
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s******r 发帖数: 2876 | 4 天然的miRNA也有很多同时表达的吧,
你可以模拟他那个结构,用pTRIPZ来表达。
sorry,没有做过lenti, 不熟悉有哪些vector可以用。有没有哪个lentiviral vector
可以同时表达两个不同的shRNA,并且有荧光marker做FACS啊? |
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i*****i 发帖数: 154 | 5 包装入病毒的是3LTR和5LTR之间,含有packaging sequence的那一段,除此之外的序列
是不会包进病毒的,例如神马氨苄抗性基因,puc ori等东西。所以计算的时候要扣除
这些东西。整个质粒10kb,包装的RNA估计8K左右(去掉2k的零碎)。所以应该没有什
么问题。Open biosystem的pTripz shRNA的质粒有13K,照样包装。 |
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j******1 发帖数: 1315 | 6 才知道和Third Generation的package system不match,大家有什么办法吗?谢谢回复 |
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z*******t 发帖数: 21 | 9 我也用的是pTRIPZ,In-vivo用的是水加Dox。配方如下:
0.5gDox溶于23mL 50% 蔗糖溶液中,注入230mL(8OZ)袋装水中。终浓度:Dox,2mg/mL
,蔗糖,5%。水上盖锡箔纸避光,一周一换。
用qPCR可以检测到RFP表达,说明此浓度可用。
试过注射和灌胃。灌胃伤害太大,腹腔注射好像导致了腹水,原因不明。也试过食物(
找别人借的),老鼠不太爱吃,不过效果不错,也可以诱导RFP表达,只是太贵,好像
一买就是一个大包装,我用不了那么多,后来就一直用水了。 |
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b**********8 发帖数: 349 | 10 楼主,请问你用pTRIPZ lentivirus建立起来的细胞系是怎么操作的?
细胞染毒后稀释传代加药挑单克隆?还是只是加药筛选后pool所有的存活细胞? |
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m**********d 发帖数: 137 | 11 多谢楼上几位的热心回复!
我所用的细胞已经带有一个puromycin resistant的luciferase construct了,因此在
病毒infection之后没有办法再用puromycin筛选,幸好pTRIPZ vector有RFP,我用FASC
sorting拿到的细胞pool |
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c*******4 发帖数: 154 | 12 对于cancer领域来说,这是一个非常不错的原始数据,值得跟进。如上所说,你必须验
证这个现象。我觉得最好的办法是能搞到inducible的shRNA,看看open biosystem的网
站,他们有pTRIPZ一类的inducible的shRNA。 |
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c*******7 发帖数: 314 | 13 tet on的可以用obs的pTRIPZ,有荧光,XhoI、EcoRI clone很好用,最好design 3‘
mismatch。pGIPTZ没用过,可以打电话问 |
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