s******r
发帖数: 2876 | 1 你这个virus以前用过吗？肯定work吗？
人primary fibroblast用spinning的方法转染pBabe-puro病毒,感觉puromycin
selection之后,细胞不长了,形态似乎也发生了变化(空载体的对照也是).
有经验的大虾show一下你的经验.前后转了两次都一样,有点失望. |
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z****g
发帖数: 3340 | 2 以前从来没做过retrovirus.virus是用cDNA克隆到pBabe-puro后, 1:1与pCL质粒一起转
到Phoenix细胞,两天和三天后收病毒,0.45uM filter过滤后感染fibroblast. 48小时候
开始puromycin selection, 感觉细胞长得很慢很慢 (对照也一样).
另外,construct transient expression很好. |
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s******r
发帖数: 2876 | 3 那你可以先用普通的细胞，比如293，来试试你的病毒，
不用加drug，感染后，western先看看。
以前从来没做过retrovirus.virus是用cDNA克隆到pBabe-puro后, 1:1与pCL质粒一起转
到Phoenix细胞,两天和三天后收病毒,0.45uM filter过滤后感染fibroblast. 48小时候
开始puromycin selection, 感觉细胞长得很慢很慢 (对照也一样).
另外,construct transient expression很好. |
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b****h
发帖数: 18 | 4 本来不怀疑这一点，但有同事说G418适用于杀死能增值的细胞。我最近打算赋予特定类
型的 neuron具有neo或puro的抗性，然后杀死其他类型的neurons和杂细胞。有哪位做
神经的兄弟用过G418或PUROMECIN筛选/杀死neuron的经验吗？我指的是元代老鼠或人的
neuron。多谢！！！ |
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M*****n
发帖数: 16729 | 6 block protein synthesis, neuron当然也能杀掉，就是慢点 |
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m*********n
发帖数: 215 | 7 这个要很慢的吧。。。不能用其他marker标记你要的neuron么？譬如带个荧光然后facs
？ |
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M*****n
发帖数: 16729 | 8 using Neo(r) is not a good idea to do this negative selection.
read more papers and you will find better selection markers.
G418
sure |
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p****z
发帖数: 31 | 9 我用的是mixture,pooled after puromycin selection. 你的意思是还是用transient?
我是觉得很奇怪，这个差别怎么会这么大。谢谢！
likely
could
using |
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L**********O
发帖数: 1761 | 10 我也是做lentivirus (pLKO.1 based vector, open biosystem)。。然后puromycin
select...
你如果用和他们一模一样的测proliferation方法还是得不到相同结果吗？
按理来说，stable cell line,敲除的更稳定，应该结果更加好才对，是不？
proliferation
transient |
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d*p
发帖数: 534 | 11 Do you have a empty vector as control? I don't like puromycin. All of my
shRNAs were cloned into plko.3G. GFP will tell you the infection rate. And
you may sort the GFP positive cells. |
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q******g
发帖数: 3858 | 13 我们用pLKO.1也有同样的问题。一般都是在split cell后一天，才加入puromycin. 一
般经过3-4天，没有感染的细胞（negative control）会全部死去。这个时候，你可以
冷冻一些细胞，用于以后的实验。而经过删选的细胞用过2-3周，就不用了。使用冷冻
的。
knockdown efficiency我的基因也只有60%左右。我觉得这个和shRNA的设计有关。当然
，很多公司会重新给你设计或者退款，如果达不到80%。 |
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c*****u
发帖数: 357 | 14 我想构建表达蛋白的stable cell line,之前已经构建了MCF10，现在用同样的方法做
infection，结果一加puromycin(2ug/ul)，MCF7细胞基本全死了，empty vector也是。
侵染时我一般加8ug/ul的polybrene。MCF7属于luminal, 听说luminal很难做侵染，不
知道有经验的朋友们有什么建议，谢谢！ |
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m*******n
发帖数: 387 | 16 如果不用retrovirus，直接转个质粒进去，用puromycine筛的话
这种stable cell line，基因是在基因组上吗？ |
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m*******n
发帖数: 387 | 17 如果不用retrovirus，直接转个质粒进去，用puromycine筛的话
这种stable cell line，基因是在基因组上吗？ |
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G******7
发帖数: 1352 | 18 puromycin加太早了，感染2-3天后再筛选
second
ml
selection |
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s******y
发帖数: 28562 | 19 这个已经试过了，没有用，因为那个质粒上是个Kan/Neo selection marker,
太tmd的没用了。因为必须至少选5天才能选出东西来，首先是大部分transient transfection 的细胞，放了那么多天，大部分转染的细胞都因过表达而死掉了，（在这个方面，作为表达用的vector 和 gene targeting 的vector 是不同的）。 我曾经试过两次，筛到后来，皿里长满了一堆根本没有荧光的细胞，让我无语得一塌糊涂。
而且stably integration 本身就是一个非常低概率的事情，如果一开始的transient transfection效率太低的话，整个皿里可能都没有一个细胞是stably 的。
对于puromycin 这种比较凶狠的药说不定还能选出来，但是我们的那个蛋白
是在别人实验室里拿到的，里面就只有Kan/Neo |
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g*********5
发帖数: 2533 | 20 sunny, could you try to replace the Kan/Neo with puromycin
with Gibson fragment?
transfection 的细胞，放了那么多天，大部分转染的细胞都因过表达而死掉了，（在
这个方面，作为表达用的vector 和 gene targeting 的vector 是不同的）。 我曾经
试过两次，筛到后来，皿里长满了一堆根本没有荧光的细胞，让我无语得一塌糊涂。
transfection效率太低的话，整个皿里可能都没有一个细胞是stably 的。 |
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f*****f
发帖数: 195 | 21 不是siRNA对老鼠细胞株效果不好，而是因为C2C12或primary myoblast转染效率偏低，
但也有人转染siRNA成功了的。
可以用病毒转染miRNA质粒，
或者脂质体转染后加质粒抗性标记筛选（如puromycin等）效果也很好。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 22 一般双抗就一起加呗。G418很慢，大概要三五天才有反应，不喜欢用，Puro很快。
胞。 |
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q******g
发帖数: 3858 | 24 我用过。5个里面当时有两个比较好。但是，用PUROMYCIN筛选比较麻烦。 |
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a*******n
发帖数: 156 | 25 多养几天试试
我以前做过一种抗癌药的dose response，如果只做两天，浓度降到一定浓度抑制率会
突然上升 |
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m******5
发帖数: 1383 | 26 急求货源，google半天无果
顺便再问一下哪里可以找到Puromycine resistant feeder cells |
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E*****s
发帖数: 39 | 27 我最近在做shRNA转染，用puromycin筛选到一些稳定的细胞的克隆，qPCR检测到大约有
50～60％的silencing effect，但是western检测不到蛋白水平降低，请问会是什么原
因呢？
我用cycloheximide查蛋白的half－life，48小时候也没什么变化。难道是因为蛋白太
稳定了，所以shRNA的silencing effect在蛋白水平检测不到？另外我的蛋白检测抗体
是兔单抗，超级灵敏，难道是太灵敏了，细微的差别在曝光后显不出来？
新人求解，愚蠢的问题还请原谅。。。 |
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E*****s
发帖数: 39 | 28 不是lentivirus，但也不是transient，只是转染48小时后，细胞重新稀释传代，换含
有puromycin的培养基筛选。
现在真是头痛阿，之前用试过三种siRNA，也是没用，真是郁闷。 |
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b****s
发帖数: 148 | 29 increase MOI
try harvest protein as early as possible, eg. 48hrs post-puromycin selection
. |
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y********g
发帖数: 782 | 30 请教大家几个问题
1、 选puromycin浓度的时候，需要提前做个proliferation 的试验来确定dose，大家
treat cells几天，是选80%抑制的dose么？
2、 作colony formation assay的时候，因为做的时间比较长，等的过程中，溶液中重
要加药物筛选么？
谢谢大家！！ |
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j******n
发帖数: 941 | 31 1、puromycin作用时间有时候会比较慢，视细胞株而异，建议做1个礼拜左右观察。建
议使用100%抑制的最低浓度，否则很可能混入假阳性克隆。
2、我一般3-5天换一次液。 |
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d*****i
发帖数: 3905 | 32 大家有没有遇到过这样的情况，细胞加了virus后直接puromycin selection一段时间，
第一次做qPCR发现knockdown efficiency不错，细胞再养一段时间后qPCR发现
efficiency变差了。
有人解释说是细胞中KD efficiency高的没有低的分裂速度快，所以养一段时间后KD
efficiency高的细胞就没有低的多，总体efficiency就变差了。
有人遇到过同样情况吗？都是怎么解决的？谢谢！！ |
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d*****i
发帖数: 3905 | 33 用lentivirus deliver shRNA， infect后puromycin select 2到3周，先做RT-PCR，显
示最高knockdown efficiency有70%，细胞冻了后解冻做WB，显示protein几乎没啥变化
。Antibody可以detect FLAG-tagged的protein，所以觉得antibody似乎问题不大。
大家都啥建议？？Thx |
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X***n
发帖数: 366 | 34 lentivirus with puromycin selection |
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b******9
发帖数: 425 | 35 做了个construct，转primary newborn astrocytes，用hygromycin来筛选stable
transfection，可是一直都没有筛出来，细胞全都死光光了。转染效率还算可以，是电
转，有30%左右。hygromycin浓度也不算高，50ug/ml。
hygromycin是用TK promoter表达的，不知道是不是因为promoter不行。试了别人的一
个puromycin construct，是pGK promoter，也基本上死光了。想问一问版上牛人有没
有经验可以传授。多谢多谢！
另外我是用CMV promoter来表达我要的基因，先转细胞，然后筛选stable line打到老
鼠上。听说CMV promoter在体内可能会被shut down，是不是也应该换掉呢？谢谢！ |
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h******y
发帖数: 351 | 36 Hygromycin浓度偏高了。你有没有先做一下kill curve找出合适的antibiotic浓度？
合适的hygromycin通常在10-30 ug/mL
合适的puromycin通常在0.3-1 ug/mL |
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J**l
发帖数: 493 | 37 一次次的跌跟斗，看来教训还是没够
前段时间做个实验需要某cell line，刚好实验室一个senior postdoc有，他也正在用
它做实验，于是跟他要了些，同时跟他简单讲了我需要用这个细胞做哪些实验，他听了
以后没有任何comments。
我拿到细胞以后用载体引入了一些表达constructs（都有GFP tag），然后花了很长时
间做出了几个stable cell lines；接下来，我打算用lentivirus来转染表达shRNA的载
体，这就需要drug selection（puromycin）来杀死未转染的细胞来实现得到stable
cell的目的。于是我就做了个kill curve，然后就很悲惨的发现这个细胞怎么杀都不死
。。当然这话夸张了，事实上是我需要正常用量10倍的药量才能杀死大部分的细胞。我
只好发信问这个给我细胞的postdoc，结果人家轻飘飘的回了一句话：Yes, the cells
I gave you are puro resistant. 我看了这话真是出离愤怒！我当初跟他讲过我以后
会用到puro selection，他听了没反应；而且，我觉得这是co... 阅读全帖 |
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b**********8
发帖数: 349 | 38 这个问题快困扰我一年了，今天特意翻墙过来求助各位大大，
事情是这样的，之前在博士的实验室一直用pLKO.1-puro shRNA干扰基因表达，用的
invitrogen的包装质粒（PLP1，PLP2和VSVG），在10cm的dish里面用HEK293FT转染，转
染用的是磷酸钙沉淀法，病毒上清用SBI的 precipitation solution（5x）浓缩，一直
都work well，偶尔偷懒奢侈一把用lipo2000转染，效率也是没得说。自去年博士毕业
回国后来到现在这个小实验室，当时雄心勃勃自信满满，打算自己包装慢病毒，用的还
是跟之前一样的质粒，细胞，只不过换到了T75的flask里面，用lipo2000转染（磷酸钙
转染法配buffer太烦，实验室pH计不准，老板对经费管的也很松，哈哈），之后用同样
的方法收病毒上清，浓缩。感染细胞后加puromycin筛选，染毒的细胞都能活下来，而
对照细胞48小时候就死光。可是收集细胞蛋白做WB却一点都看不到knockdown，前前后
后重复好几回了，都是一样的结果，现在无奈把这一块交给公司做了，但是自己还是不
死心，今天写出来问问大家... 阅读全帖 |
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b**********8
发帖数: 349 | 39 特别纳闷的是细胞能耐受puromycin，证明病毒应该是转进去了，可是为什么看不到一
点点的knockdown呢，求大神分析分析 |
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b**********8
发帖数: 349 | 40 1,恩，好建议，我也打算这么做。
2，puromycin杀两天，未染毒的对照细胞全部死光光，染毒的细胞活的很好。
3，已经着手搞了，
谢谢你的建议！ |
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m*********D
发帖数: 1727 | 41 先道歉--我上面回答网友的havala的第二个问题时搞错了：
”2. 你是在donor 上引入酶切位点（通过silence mutation）, 然后PCR酶切鉴定
吗？
**是，PCR后梅切。但没有silence mutation.我需要只改变一个AA。“
我理解silence mutation错了。是，我在donor上通过silence mutation引入两个酶且
位点，然后用这两个酶作geno-typing的。大约是10M细胞，lipofectamine3000作
transfection,三天的puromycin sellection，除掉non-transfected的细胞。约有1%的
细胞能survive,也就是100，000细胞。我用mutant的phenotype作下一步筛选，就是
mutant在一种特殊medium里可以生长，但wild-type不能。这个筛选了三个礼拜后，大
约拿到100 colonies.这其中约25%为double-replacement，50%为single-replacement,
还有约25%在酶切上看不出来，也没有sequenci... 阅读全帖 |
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w***a
发帖数: 4361 | 42 我的也是这种情况，puromycin筛选以后，随机挑了6个clone，
结果5个是wildtype，只有一个是突变。
这个突变克隆，测了20个genomic PCR product，发现全部是同一个突变。
当时偶也觉得蛮奇怪的，后来western做完，目标蛋白确实没了，就不管了这事了。。。 |
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O**********a
发帖数: 317 | 43 请教真不敢当，你是前辈。
我刚好做了这个。primer扩增就是你理解的。
合在一个载体的也可以，如果你喜欢。看你偏好了。
建stable cell line也不难啊，两到三周。
我用ES细胞。有Yusa的那篇nature biotech文章，说理论上他们测试的一个拷贝的cas9
就能work。当然他只测了几个gRNA。我想挑个中等表达cas9的就够了。
[在 midwestPstD (中西部博士后) 的大作中提到：]
：他science文章的protocol里是puromycin七天，然后是drug treatment七天或十四天
。要整合的话（stable cell line)，时间是该差不多了。
：
：........... |
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m*********D
发帖数: 1727 | 44 你看我昨天来问的时候就是这个上面有些糊涂。我现在也还担心：如果CRISPR
function很快，virus进细胞后表达gRNA/Cas9，马上ko了一个pathway上的基因，3天的
puromycin selection期间，没整合进genome,这个细胞也可能survive的。所以，我以
为sequencing整个genome来找呢。
既然是比较两个pool,遗漏一些或false positive是难免的。估计搞的几个就好。现在
的signal transduction的“网络”已经很成熟了，找到几个估计就会有谱了。看了
Feng zhang的method section,细胞用量很大，估计是不是考虑了整合进genome的效率
不是很高这个因素。
我这个因是新的pathway,自己有potency到了drug级别的small molecule inhibitor，
所以，就想自己试试。
谢谢！
gRNA |
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E*********4
发帖数: 16 | 45 不是融合蛋白。蛋白下游有SV40 promoter启动的GFP和Puromycin 标签。
谢谢！
列? |
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m****p
发帖数: 122 | 46 最近在做利用lentivirus表达sgRNA KO一个基因，转染第一步就出现问题。
针对两个位点病毒是sigma定制的，寄给我的滴度是5*10^6/ml和1*10^6/ml，我用它们
转了两个细胞（12孔板，每个孔10微升病毒），该病毒正常应该有GFP及puro抗性基因
表达的，我在转染24小时和48小时居然没有看到任何荧光。
我原来用过santa cruze的shRNA病毒，转染后用puromycin筛选，转染效果还是可以的
，最后也筛选出了我要的单克隆细胞。
有人遇到过我现在这个情况吗？怎么解决？
谢啦 |
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b******9
发帖数: 102 | 47 我做过H9 ESC定点knockin，不过用cas9没成功，用的是TALEN，puro筛选，阳性率大概
在60-70%吧。胖老师可以参考Rudolf的文章：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21738127
我个人觉得要注意以下几点：
1.在比如293T等比较好转的细胞中做个切割实验：T7EI或者酶切都行。
2.如果是用cas9，那donor载体的同源臂需要注意也可能会被cas9切割，最好在同源臂
PAM附近做几个同义突变；要是用TALEN就不存在这个问题了。
3.donor同源臂至少得有个1kb吧，反正我当时是这样设计的。
4.筛选标记：是puromycin还是荧光？如果是抗生素的话建议用puro，效果很好，做之
前得先摸个最佳用药浓度。然后就是筛选时间，H9的话我们筛了2周。
5.转染效率，原代一般都比较难转染吧？我们用的是电转。
6.donor载体我直接用的pBluescript SK(+)，转之前线性化处理一下。
7.阳性克隆鉴定有条件的话上southern，没条件用PCR吧，注意在同源臂外面设计引物。
8.再有就是防止细胞污染。 |
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s*****i
发帖数: 315 | 48 Es cell 的话不要筛选太久、puro 两天就够了，电转后二十四小时开始加药，4天以后
就可以挑克隆了
质粒不用线性化也有很高的效率
: 我做过H9 ESC定点knockin，不过用cas9没成功，用的是TALEN，puro筛选，阳性
率大概
: 在60-70%吧。胖老师可以参考Rudolf的文章：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21738127
: 我个人觉得要注意以下几点：
: 1.在比如293T等比较好转的细胞中做个切割实验：T7EI或者酶切都行。
: 2.如果是用cas9，那donor载体的同源臂需要注意也可能会被cas9切割，最好在
同源臂
: PAM附近做几个同义突变；要是用TALEN就不存在这个问题了。
: 3.donor同源臂至少得有个1kb吧，反正我当时是这样设计的。
: 4.筛选标记：是puromycin还是荧光？如果是抗生素的话建议用puro，效果很好
，做之
: 前得先摸个最佳用药浓度。然后就是筛选时间，H9的话我们筛了2周。
: 5.转染... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 49 1. 存活效率非常之低，低得令人发指
Try "conditioned" medium, which contains growth factor and cytokines blabla.
..
This trick works pretty much well for my neuroblastoma single cell
2.drug resistent markers，比如一个puro
I have horrible experience using puromycin, that you first establish "
survival curve" to figure out the optimal puro concentration to select those
puro-resistant,
but it seems everytime cell growth condition is slightly different, so the "
optimal" condition won't work at all.
3.Question: what's th... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 50 CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCC
CACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGG
GTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGG
bGH PolyA signal
mammalian terminators (SV40, hGH, BGH, and rbGlob) include the sequence
motif AAUAAA which promotes both polyadenylation and termination. Out of
those listed, the SV40 late polyA and rbGlob polyA are thought to be more
efficient in terminating transcripti... 阅读全帖 |
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