o**4
发帖数: 35028 | 1 我用feng zhang实验室的网站设计的结果如下：
http://crispr.mit.edu/job/9989720016962422
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scored by inverse likelihood of offtarget binding
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Guide #1 68 AGCTGTAGCATTTTCTAACT TGG
Guide #2 62 AGCTACAAACTTTAAGACAA AGG
Guide #1 44 TTACTTTCTGAAAATCATCT TGG
Guide #3 43 TTAAGCTTTCTATTGTTTGT CGG
Guide #5 40 TTTGCCTGAACAACTTAAAG AGG
Guide #4 31 CAGAAAGTAAAACTAAAAGT TGG... 阅读全帖 |
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r********s
发帖数: 149 | 2 不用加，20bp加上4bp overhang.cloned into pX330
有没有人知道那些数字是什么意思？数字越大越specific or more efficient? |
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o**4
发帖数: 35028 | 3 我用feng zhang实验室的网站设计的结果如下：
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h****a
发帖数: 65 | 4 我是新手，正准备做crispr point mutant, 很多问题想请教
1. Crispr载体选择， px330, px335(nickase), px459(puro+), px462(nickase,
puro+)
Nickase的系列在做KO的时候效率会高些，不知道做knock-in mutation哪种效率更高？
你所说的selection marker是crispr载体上带的selection marker(eg.
Puro+), 还是donor上带的selection marker? 我准备用ssDNA做donor, 做点突变的
时候好像也不方便在donor上引入selection marker
2. 你是在donor 上引入酶切位点（通过silence mutation）, 然后PCR酶切鉴定吗？
3. 一般knock-in mutation挑克隆都挑一百个克隆以上，具体操作的时候，是不是
在大板上有单克隆后，转96孔板里面，然后duplicate， 其中一板用来做PCR鉴定？做
PCR鉴定的模板是96孔板里面的细胞提取的g... 阅读全帖 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 5 1. Crispr载体选择， px330, px335(nickase), px459(puro+), px462(nickase,
puro+)
Nickase的系列在做KO的时候效率会高些，不知道做knock-in mutation哪种效率更高？
你所说的selection marker是crispr载体上带的selection marker(eg.
Puro+), 还是donor上带的selection marker? 我准备用ssDNA做donor, 做点突变的
时候好像也不方便在donor上引入selection marker
**我用的459，主要是要它的puro-selection。这个是筛选transfected cells的。也可
以用带GFP的vector,作cell sorting. 我原文说的selection和这个无关，是指有HDR发
生后的筛选。是，这个selection marker是一个头疼事，我也不太熟悉。
2. 你是在donor 上引入酶切位点（通过silence mutation）, 然后PCR酶切鉴定吗？
*... 阅读全帖 |
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O*****l
发帖数: 97 | 6 干嘛这么麻烦，用CRISPR质粒 （px330系列）transient表达Cas9和gRNA，同时转两个
，KO效率还是很高的。
如果要做整合，用lenti表达Cas9, 再转入gRNA就是了。不过lenti-Cas9的titer较低，
整合效率不高。 |
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发帖数: 1 | 7 大家好，我分别用了来自韩春雨实验室的版本，自己将NgAgo移到PX330质粒的版本（前
后都加NLS），另外还有根据韩的文章给出的氨基酸序列，经过人源化密码子优化的版
本。三个版本分别与GFP的gDNA（韩paper里设计的gDNA）共染GFP阳性的293T stable
line，在293T细胞里做了韩春雨的G10 gDNA，在Cos7细胞里做了的TYR基因，另外还注
射了一大批卵，均无一个阳性结果。
在 2016年6月26日星期日 UTC+8上午4:28:02，。。。。 Zhou写道： |
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发帖数: 1 | 8 Myx
上午2:23（8 小时前）
我也刚试了一下。 用了优化的密码子。转染的N2A 细胞。跟之前成功的一个px330比较
。发现NgAGo没有一点效果。郁闷。白白浪费了这么多钱和时间。 |
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发帖数: 1 | 9 From Google 网上论坛
Michael Wilson
2016-07-15 16:54（1 分钟前）
将帖子翻译为中文
Hello,
We have twice attempted to test the NgAgO addgene plasmid in HEK 293 cells
using lipofectamine transfection and the EGXXFP split reporter assay. As
many are aware, this assay requires DNA cleavage in the EGXXFP plasmid to
restore GFP expression.
We ordered oligos with 5' phosphorylation and transfected directly or PNK-
treated an aliquot prior to transfection, just to ensure 5' phosphorylation;
neither of these methods ... 阅读全帖 |
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w*p
发帖数: 16484 | 11 他自己重复出来没用，必须得第三方独立实验室重复出来才会被科学界接受。 |
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i***9
发帖数: 106 | 12 这个是整体的大环境的问题，所有人的诚信都基本为零。
小宝当初也是自己人监督的，没有人说什么。因为大家相信这个机构背后的credit。
现在的情况是，就算国内某个人做出来了，问题是你信么？
其实澳大利亚的实验室，或者西班牙的实验室确实不算顶级，多说也就是中游水平。但
是因为是独立实验室，也因为是洋人的实验室，所以很多人相信。
尼玛，橘生淮南则为橘，生淮北则为枳。如果就中国的实验室能重复，很难让人相信这
是科学。
NBT潜在的意思已经很明确，如果韩故意隐匿了某些关键步骤的话，同样面临撤稿的命
运。所以，如果韩真能拿出来，smart版，而且证明work的话，NBT同样会以诚信的理由
撤稿。如果不这样，NBT就不用搞了，所有人都写个垃圾protocol糊弄过去，即便结论
可靠，对整个科研环境会造成重大伤害。 |
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o*****p
发帖数: 2977 | 13
这就太夸张了。施一公颜宁和那么多人发了那么多CNS，怎么一篇文章就结论“所有人
的诚信都基本为零”？
这篇文章出来，开始大伙都信任叫好，就是因为大环境在那里，大家普遍信任科研的
结果和诚信。而这信任，不是凭空而生，而是之前很多好工作换来的。
这次韩春雨迅速落马，说明至少在重大的结果方面，科研界的自纠能力很强。 |
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w****e
发帖数: 1883 | 14 扯吧，大家叫好不是对中国科研对信任，是对NBT的信任。
这次这么快被揪出来，也不是什么中国科学界自我纠正的能力，而是网络的力量。
如果没有网络，韩春雨已经当了长江学者吃香喝辣了。
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i***9
发帖数: 106 | 15 哈，哈，哈！
诚信是指别人对你诚实可靠的评价。不是自我感觉良好。
你把颜宁在第一时间的评价“如果数据solid的话，好极了”，仔细读上30遍，告诉我
什么是诚信。很多时候就是人你说的天花乱坠，我就是不信。
韩的文章，还没有盖棺定论。不要着急用落马这个词，也许，希望韩能杀个回马枪。要
不然，以后小实验室的生存就是雪上加霜。
如果是这样的话，对于颜宁的任何辩驳都变得苍白无力。 |
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发帖数: 1 | 16 国内科研界纠错能力一点也不强，你去看看科学网，到现在还是各种给韩找理由 |
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o*****p
发帖数: 2977 | 17 OK，但至少在目前的环境下，中国科研也没有力量为非作歹。
现在中国科研水平也是世界承认的。没有很多，非常扎扎实实的结果，也没有这个承
认。 |
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发帖数: 1 | 18 140nt？你是表达sgRNA吗？为什么不直接用Fengzhang的PX330，PX459一类已经构建好
的质粒。 |
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