s*******l
发帖数: 2445 | 1 一个朋友之前做的一个knockdown/knockout gene expression的technique申请了专利,
最近和他聊天谈起把它商业化的前途。
他的技术的背景是：RNAi Knockdown的efficiency有时候很低，他的technique可以和
RNAi一起用来更好的降低endogenous的蛋白表达水平。所以他想考虑做一个service或
者reagent的公司提供一些热门gene的combined knockdown,也可以根据客户要求来做
customized的服务。
现在在做一些初步的市场分析调查，因为自己不是之前不是做这些的，想请教一下有没
有好的关于RNAi Knockdown的efficiency的综述文献，或者目前普遍在用的siRNA的一
般的knockdown效率的数据。非常感谢！ |
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a****c
发帖数: 339 | 2 I just did that.
Get info from your particular airline.
For American Airlines, EU destination may be more strict (no reagent of anim
al origin), but China is Okay (should be less than 100ml or something like t
hat).
Put it in the checked luggage. |
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t******y
发帖数: 716 | 3 if you mixed well, you should be able to see what your boss expected. The
reason is simple that both plasmids have the same chance binding to every
single lipofectamine 2000 particle(if you're using it as transfection
reagent).Each lipofectamine 2000 particle probably can bind a bunch of DNA
and sometimes the particle size is pretty big,ranged from ~40 nm to ~180 nm
in diameter. There is a paper talking about DNA and transfection particles.
http://www.biomedcentral.com/1472-6750/8/23 |
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s******y
发帖数: 28562 | 5 Also, if you have to do this, you need to use the most sensitive detection
reagent,
such as the Western Femto detection kit from Pierce Chemical |
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c**a
发帖数: 94 | 6 以前没有用过昆虫细胞,现在需要从SF9 细胞里表达蛋白并纯化. 之前试着用
lipofectamine
tranfect细胞, 没有收集到多少蛋白. 请求有经验的高手给个protocol或者方法,用什
么transfection
reagent比较好. 怎么lyse和纯化蛋白. 谢谢了. |
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J********n
发帖数: 534 | 7 这个不用transfection reagent。
需要先制备P3 virus (就是P1 amplify三次)，sf9 cells很容易break，比E.coli更简
单。之后最好ultracentrifuge 40K, 1hour.
要更具体的，上invitrogen或者BD Biosciences看看。他们产生P1 virus所用方法不同。
当然，比较新的BacMam就更简单了。 |
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f**********e
发帖数: 1994 | 8 很多 NGS 的厂商都是先铺机器到 genome center, 再用 reagent 赚钱的。
不高兴了 genome center 还可以退机器。 |
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A****w
发帖数: 244 | 9 ICP-MS是个好方法，确定S，Fe的含量，计算摩尔吸光度~
amino acid analysis是个很原始的方法，也可以用来算。
利用很多cys的话，你可以在变性条件下作Ellman's reagent和cys反应，测定412 nm的
abs.
然后反推你的蛋白浓度。 |
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d******r
发帖数: 124 | 11 有什么transfection reagent推荐？我试了磷酸钙，neuroFECT,GenCarrier-2，效果都
不理想，转染效率很低（平均2，3个/8000 neuron），死掉很多。因为需要等轴突树突
分化之后再转染，所以不能用电转和amaxa。用病毒又太费时。各位大侠有什么经验可
以传授吗？ |
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d******r
发帖数: 124 | 12 我主要看单个神经元的形态，转染效率并不需要非常高，大概一个波片里有100个转染
成功就足够了。有没有transfection reagent可以达到这种效率？
就是想偷点懒，用病毒工作量太大了:) |
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m***T
发帖数: 11058 | 13 是卖什么的？instrument,software,reagents...? |
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K*o
发帖数: 96 | 14 我正在做Lentivirus，但是在Packaging的时候总是遇到问题。我用的是CellBio Labs
公司的Plat-A细胞，他们公司介绍上说是Stably expressing packaging gene的293细
胞。
我的做法是：第一天把细胞种上。第二天早上细胞贴壁贴的很好，然后转染，我直接把
Fugene和DNA的mix加到Media里。第三天早上换新鲜的Media。问题是我每次
Transfection以后，第二天这些细胞都会漂起来。看上去那些细胞并没死，但是就黏在
一起然后漂在Media里。几次了都这样。转染3天后，我把所有的液体收集起来后离心，
然后用上清infect breast cancer cells，效果很差。我觉得应该是Transfection的问
题。版上有人碰过类此的问题么？这到底是怎么回事呀？为什么我的细胞总是转染后漂
起来呢？平常传代的时候它们看着都挺正常的。
有没有其他的办法？或者大家用什么细胞或Reagent做Lentivirus Packaging效果好的
，分享一下？ |
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l**l
发帖数: 458 | 15 which one is better trizol, tri reagent, RNA bee?
Thank you! |
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H***e
发帖数: 223 | 16 我没有用过trizol，用过后两种，感觉tri-reagent比RNA bee效果好很多。 |
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f*********r
发帖数: 1233 | 17 那就是说，样本来源比较丰富。这就比较好办。
trizol，白色/无色，忘了哪个公司的，不好。一是保存在4度会呈凝胶状。二是离心分
层的时候，界面不清晰。
trizol，粉红色，thermo。一般。有的时候rna沉淀是胶冻状，不太容易和杂质区分。
tri-reagent，粉红色，mrc。不错。技术熟练者可提到很多rna，而且纯度可以很高，
接近于2.0。要点是，不要贪多。每个样品不要太大块组织，够30-50微克的rna就好。
以上三者缺点是提纯步骤多，时间长。
rnazol，蓝色，mrc。不错。优点是一步提纯，如果不算酒精清洗这一步，半小时内可
完成。缺点是，纯度不如前者。1.8没问题，1.9以上就很少见了。
rna柱，qiagen。很不错。优点是可以很纯，大于2.0。缺点一是贵，二是对样品中rna
的量限制得比较严。多了不好，少了也不好。
rna bee没玩过，可参照上面老兄说的。
如果你做的real-time pcr比较稳定，引物特异性敏感性好，反应条件不严格（比如退
火温度，Mg离子浓度等），就没必要选rna提纯柱。如果是新手，可以先试试rnazol。
步骤简单易掌握，价钱不贵，现 |
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h********n
发帖数: 4079 | 18 Of course immortalized cell lines have some property of cancer cell (such as
being immortal). However, they are not invasive cell lines (transformed
cell means invasive cell). So in your question you can still use
immortalized cell lines as normal cell while transformed (spontaneous or by
reagents) cell lines as cancer cell.
However, don't expect too much from this kind of experiments because the
differential toxicity may not be obvious. If I design the experiment I will
do the following:
1. m |
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q*****n
发帖数: 331 | 19 check all your reagents first. See which one(s) are made new. |
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s******y
发帖数: 28562 | 20 This is not true.
I think the potential toxicities of many reagents are well tested and listed
in the MSDS. You should read it if you are curious. |
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d****u
发帖数: 1553 | 21 betaine是个办法，还可以加DMSO，还有一些公司提供GC RICH reagent。比如罗氏。 |
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f***n
发帖数: 34 | 22 Yes. You maybe need to redesing primers. Also you need know that 5' RACE is
more challenging. Only for 3' RACE, i bought all the reagents from different
companies and combine to do it and it is cheaper. For 5' RACE, it is very
important to get full length mRNA or cDNA. Some kits can help you to achieve
this. |
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m*****i
发帖数: 29 | 23 The idea of "pure, not including the postdoc salaries" is definitely needed
to be corrected. I am look at the breakdown of our budget. 70% of it goes to
personnel compensation, including post-doc salaries and benefits. In order
to have 1 million reagent (including animal cost) budget, the lab needs at
least 3 million total budget and 33 persons, probably 3 PIs. So the # you
are talking about is from pure outsider view. My suggestion is to find the
right lab for you, NIH labs could be much better |
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s******y
发帖数: 28562 | 24 Lipofectamine + Plus reagent |
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s******y
发帖数: 28562 | 25 Up to 30% with Lipofectamine + Plus reagent |
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d**********t
发帖数: 20415 | 26 你一开始就说那个区段测不出，很可能那个区段就有问题，测序应该是最好的办法了
其它么，那别的质粒和引物做个positive control确定PCR的reagent没有问题
取菌X做个菌落PCR，看看能不能P出来，有些大的plasmid你提取的方法不好容易断
我能想到的也就这么多了... |
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C*******e
发帖数: 4348 | 27 谢谢建议。很多你提到的我都做了，PCR reagent肯定没问题，因为同样的master mix
，加不同的
primer\template是可以P出产物的。另外这个endogenous plasmid不大，8kb不到，我
提了以后
跑过胶确认过。
有时候真的很不喜欢那些从别人实验室要来的材料啊。 |
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h******a
发帖数: 712 | 29 有同事建议我去查data sheet of the reagent. 我用的是 BD bioscience 的，根据它
的数据，是0.3～3.3x10^8 U/ml
(range很大），那就应该是30～330 U/ng, 这样推算对吗？
mL. |
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g*********5
发帖数: 2533 | 30 I want do cotransfect and find all my cell die after 3days with
lipofectamine 2000. and which reagent you used in the cotransfect experiment?
thanks, |
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v***a
发帖数: 1242 | 31 transfection的efficiency是否跟cell density相关呢？细胞少了是不是efficiency就
高，但是toxicity会大？
我做plasmid DNA transfection的时候，发现普通control（没有加任何transfection
reagent的）和有vector plasmid transfection的control相比，我要观测的蛋白表达
不一样，有vector的蛋白少了很多。不知道这是怎么回事呢？
谢谢～ |
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n********k
发帖数: 2818 | 32 it is not a proper comparison, many transfection reagents impact on cells...
think about it, they are peneratring
cell membranes...
transfection |
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c*********r
发帖数: 1312 | 33 也问个有关Northern Blot的问题
实验室需要做Northern，但之前没人做过。现在有500-1000bp的被Digoxigenin标记的
Anti-sense RNA探针。有Li-cor Odyssey的远红外检测的仪器。现在想找合适的试剂设
计一下怎么做，和大家讨论讨论。
方案1. 看了一下Roche的那个DIG NORTHERN STARTER KIT，最后用的是anti-
digoxigenin-AP。查了一下Odyssey的Fluorescent Reagent Compatibility，Odyssey
能检测NBT/BCIP，但是可能不能定量。
方案2. 抗体直接找一个Anti--digoxigenin-X，X能被Odyssey检测，比如IRdye，Alexa
680什么的。
方案3. 先找个一抗比如mouse/rabbit anti-Digoxigenin，然后用已有的二抗anti-
mouse/rabbit-IRdye680/800CW来检测，有点像Western blot。
还有个关于灵敏度的问题： |
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c****3
发帖数: 47 | 34 buy the reagent yourself if you are confident about the plan which ensure
the badly needed paper |
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D*********t
发帖数: 370 | 35 Maybe you should ask your boss to request. It is difficult to get cell
lines or other complicated reagents.
although |
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p*****m
发帖数: 7030 | 36 学生更要学呗 我需要的东西一般都是自己email要 除非极少情况下对方不理睬才会动
用老板的关系（因为可能要offer对方co-authorship）；反过来 给我发信要reagent的
也有不下几十封信了 99%是学生博后直接发的 |
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y******y
发帖数: 107 | 37 是的，要另外多买一个RNAprotect Bacteria Reagent 。多谢！ |
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k*******c
发帖数: 142 | 38 你如果不是美国人，你是不可能作此类的研究：it is one of CDC classfied
reagents |
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s******y
发帖数: 28562 | 39 I think this was a hypothesis or assumption people had have for a long time
without formal proof for the relationship between cachexia and death.
True, many patients with terminal diseases usually die with symptom of
cachexia. However, is it merely a side result of the dying body? Or is it
part of the pathological cause of death? This "cause" and "effect"
relationship was never vigourously or formally tested.
The reagent used in this study acts directly on muscle without effects on
cancer progre |
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w******e
发帖数: 1187 | 40 common mistake is leaking of reagent to adjacent wells. did you read the
whole plate? any signal in blank wells far away from any sample wells? |
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k*****o
发帖数: 1486 | 41 阿...我别把别人家误导了.
一般molecular biology lab存细胞或者enzyme的时候用普通冰箱(不是frost-free的),
这样会使它们更稳定.
Reagent如ATP,NAD(P)H,FAD(P)H为了严格的enzymatic assay,也会放在里面.
其他东西能4度放着的,比如说抗生素什么的就放有defrost功能的冰箱里也无所谓.
另外,frost-free冰箱可以随便开关,普通冰箱不suppose你经常这么做的..| |
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M******t
发帖数: 555 | 42 试过lipofectamine／2000，效率太低了。谢谢。 |
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v***a
发帖数: 1242 | 43 我用的是NOVAGEN的RIBOJUICE，还不错 |
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z****i
发帖数: 35 | 46 Macrophage, DC, 我们用的是polyplus的INTERFERin,效率可达80% |
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w******e
发帖数: 1187 | 48 土人第一次做，全盘follow trizol的protocol。为省reagent用了100mg tissue
per ml trizol。发现以下问题，请达人指点：
1. chloroform extraction后的precipitation，为什么用isopropanol？室温
incubate也让我很困惑。。。
2. 做了两次，第一次是heart，拿到RNA很顺利，测OD时发现：260 peak偏向270；
230附近有极高的峰。看来chloroform和precipitate后wash的步骤都不太effective？
3. 第二次做liver，搞到巨多RNA，很oily，dry了之后pellet死活不溶，试了
60oC加热，加大volume，最后还是有很多不溶。是不是trizol用少了？
4. 用了hand held homogenizer和pestle+mortar两种tissue homogenization
methods，run了urea agarose gel（顺便请问大家都用什么denaturing gel），
18S:28S rRNA大约1：1，很困惑degra |
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v***a
发帖数: 1242 | 49 我在研究某个蛋白在其overexpress情况下对某个器官的作用。想给老鼠注射含有这个
蛋白insert的plasmid DNA，第一次做，不知道有些什么需要注意的？是不是可以用PBS
作为等价于in vitro中溶解DNA的buffer/media？我在in vitro中overexpress的时候，
用的transfection reagent是QIAGEN的effectene，不知道给老鼠注射的话也仍旧可以
用这个吗？或者大家有推荐的吗？
非常感谢！ |
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m*********7
发帖数: 5207 | 50 不需要用lipid based transfection reagent。 |
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