t**********n
发帖数: 283 | 1 Many thanks.
As for the control, we have a paralled transfection with GFP plasmid, whose
expression is low while positive.
Renilla readouts are 2~4，evan using different amount of plasmid, which is
almost same as the blank(就是96孔板上啥也没有的wells).
Luciferase readouts are 8~12( expected as negative).
We just had another experiment: luciferase readouts ~60, expected as
positive while Renilla readouts 8~11.
Not sure whether I expressed myself clearly or not.
is
3
his
worry |
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t**********n
发帖数: 283 | 2 We just had another experiment: luciferase readouts ~60, expected as
positive while Renilla readouts 8~11.---那这个是不是表示转上了？？
谢谢！ |
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发帖数: 1 | 4 我用的是psicheck-2的质粒，就是Renilla和Firefly在同一个plasmid上。Renilla是
control
我研究的这段noncoding序列有复杂的secondary structure，而且大概2kb，所以很可
能这样的序列会影响整个psicheck-2的空间结构和表达，包括作为internal control的
Renilla。
psicheck-2-noncoding-SNP-A和psicheck-2-noncoding-SNP-B，每次我用相同量的质粒
，相同数量的细胞转染，这个internal control的Renilla总是有明显差别；所以觉得
这里的control是没用的，但同时也说明在转录水平SNP-A和B有差别。
所以我的问题是：
1. 还是用这套系统，但我做RNA level的qPCR，我用GAPDH来控制细胞数量，同时我保
证转染加入的plasmid是相
同的量，那么我做出来的表达差别是否可信？可否发表？
2. 当然我可以重新找一个single Renilla vector，把noncoding插到这个vector上，
然后co-tran... 阅读全帖 |
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r*****d
发帖数: 366 | 5 我也被同样的问题困扰。。
我不用转染TF,只是加药。。结果加了药以后renilla的读数成比例的上升，导致
firefly/renilla的比例还是不变甚至下降。我看到有些CELL paper,就直接做firefly,
不做renilla...
但确发现Renilla control老是和firefly成比例的增高或降低 |
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r**********e
发帖数: 587 | 6 在用psicheck2这个dual luciferase研究我的5‘UTR的SNP对于基因表达的影响；
Renilla和Firefly都是在一个plasmid上的，但被两个不同的promoter驱动。5’UTR放
在Renilla前面，而Firefly作为internal control可以控制sample amount之类的因素
Plasmid1: PromoterA---5'UTR-SNP1---Renilla---PromoterB---Firefly
Plasmid2: PromoterA---5'UTR-SNP2---Renilla---PromoterB---Firefly
现在的问题是，我用“同样量”的Plasmid1和Plasmid2来转染，也是大致“同样数量”
的细胞，可总是发现Plasmid1的Firefly level总是Plasmid2的两倍多；换句话说，我
觉得我作为internal control的Firefly也受到SNP的影响。
另外，其实我的这个5'UTR是类似G-quadruplex的区域，大概2KB（占了整个plasmid的1
/4），我很肯定... 阅读全帖 |
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p****o
发帖数: 133 | 7 情况是这样的：
我用的是双荧光系统。目的基因reporter和renilla共转。renilla值还可以，但目的基
因reporter不表达。怀疑reporter有问题，但换作细胞系，目的基因reporter和
renilla 都好好的。
有人遇到过这种情况吗？为什么reporter在原代细胞中这么难表达？ |
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L**********O
发帖数: 1761 | 8 我用HEK293T细胞，FIREFLY读数大概是２００００００，RENILLA读数大概是4００００
０。
但是我必须用osteoblast做实验。。FIREFLY读数大概是６０，RENILLA读数大概是２５
０。。
一开始怀疑是transfection的问题. 我用的是Lipofectamine。转染GFP以后，镜下观察
转染率大概50％。。
不知道该怎么改进了～～ |
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b**********8
发帖数: 349 | 9 如题，最近做dual luciferase reporter assay，主要是想看在癌细胞中敲除某一基因
A后，对另一基因B启动子活性的影响。（已经证实敲除A后能下调B的mRNA转录和翻译表
达）。我尝试过两种不同的转染顺序，如下：
1）24 well plate铺板，第二天转染A的siRNA,第三天转染B的启动子报告基因质粒，第
四天收细胞assay，发现siControl和siA的renilla的读数相差很大，有时能达到10倍左
右，出来的ratio也经常是千奇百怪，忽高忽低，难以解释，
2）考虑到可能是先转染siRNA会影响后续质粒的转染效率。于是换方案，先在6孔板中
铺板，第二天转染质粒，过夜后换液，转染24小时候胰酶消化，将细胞铺到24孔板中，
24小时后再分别转染siControl和siA，出来的结果漂亮多了，至少data不像前一种方案
那么难看了。
我想问一下，第二种方法是否合理，虽然两种方法我都在文献上看到过，但是私以为第
1中方案似乎更为合理，但是在我们的实验中，它对renilla的影响实在太大。
另外，想问一个lipofectamine2000的转染问题，以6孔板... 阅读全帖 |
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b**********8
发帖数: 349 | 10 有的问题已经在别的帖子里发过了，但是关注度不够，到现在没得到答复，现在贴到这
里归个总，大家一定要帮帮我，凡是看过这个帖子的都给我点意见吧，特别是艳阳天MM
啊，Oncogene版主啊，给点权威的意见吧，小弟先谢谢你们了
问题1，
最近做dual luciferase reporter assay，主要是想看在癌细胞中敲除某一基因A后，
对另一基因B启动子活性的影响。（已经证实敲除A后能下调B的mRNA转录和翻译表达）
。我尝试过两种不同的转染顺序，如下：
1）24 well plate铺板，第二天转染A的siRNA,第三天转染B的启动子报告基因质粒，第
四天收细胞assay，发现siControl和siA的renilla的读数相差很大，有时能达到10倍左
右，出来的ratio也经常是千奇百怪，忽高忽低，难以解释，
2）考虑到可能是先转染siRNA会影响后续质粒的转染效率。于是换方案，先在6孔板中
铺板，第二天转染质粒，过夜后换液，转染24小时候胰酶消化，将细胞铺到24孔板中，
24小时后再分别转染siControl和siA，出来的结果漂亮多了，至少data不像前一种方案
那么难看了。... 阅读全帖 |
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q**********0
发帖数: 335 | 11 最近用共转染实验检测一蛋白对某promoter(firefly luciferase reporter
)的激活作用。按照惯例，用Renilla Luciferase (TK promoter)作transfection
efficiency control，但确发现Renilla control老是和firefly成比例的增高或降低，
查文献，没有任何线索表明会TK promoter被我们所调查的蛋白激活，以前用共转染实
验检测另一蛋白也遇到相似的问题，似乎这种体外表达的蛋白对任何一种promoter都有
非特异的激活or抑制，不知版上同仁是否遇到同样问题？用其他什么办法控制
transfection efficiency consistency更好？ |
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c***y
发帖数: 615 | 12 转录因子是forkhead family之一, expression construct 来自pCMV (pCMV-TF)。3'-
端序列已测得体外结合这个转录因子，luciferase constructs 来自promega pGL4.12
和 pGL4.24 (pGL4.12-3'DNA and pGL4.24-3'DNA, respectively)。 pGL4.12 无
promoter, pGL4.24有minP 作为promoter。Transfection 的Internal control 是
pGL4.74, HSV-TK-Renilla
control groups: cotransfection of pCMV-TF和pGL4.12; cotransfection of pCMV-
TF和pGL4.24; cotransfection of pGL4.12-3'DNA 和 pCMV; otransfection of pGL4.
24-3'DNA 和 pCMV
结果是：in the presence of minP （pGL4.24系列）,转录因子可以提高luc... 阅读全帖 |
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c***y
发帖数: 615 | 13 谢谢回复。能详细讲一下reshuffle的具体设计方案吗？你是担心任何3'端的插入片断
都会影响luciferase level?
我其实test 了3个不同的in vitro selection products ( 序列完全不同，但长度在
100-200bp), luciferase reading （after normalized with against Renilla
reading） 分别是：0.6, 1.35, 1.1 (control reading 是0.39)
24 |
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B******o
发帖数: 496 | 14 你这两数据都不太正常啊。一般状况下 firefly都能几千上万，renilla也会上千（具
体数字根据transfection的ratio和量有所变化）。
同意楼上的，你最好pGL-control, basic加RL-tk做control试一试，看看测试的流程，
试剂啥的是不是有问题 |
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n******u
发帖数: 418 | 15 以前做luciferase assay
control一般都是b-gal
但是最近新的一批实验发现gal的表达被overexpression的protein repress的很厉害
试过pAct-b gal和pCH110 b gal都是一样的情况
所以问一下，除了用renilla luciferase做control还有其他什么control可以尝试么？ |
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p****o
发帖数: 133 | 16 我用的是AMAX电转.我觉得转染不是问题，应该是转进去了，因为renilla有表达，还不
错。为什么reporter就是不表达呢？我用免疫荧光验证过了，信号是被激活的。
reporter也应该表达啊。
是不是原代细胞本来就对reporter不敏感啊？
2 楼的同志你后来怎么办了？放弃了还是找到别的解决办法了？ |
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w*********e
发帖数: 98 | 17 我前段时间刚遇到过同样的问题。换成CMV promoter的renilla 会好很多。个人认为
我们研究的蛋白对TK promoter 有一定的特异激活作用。希望对你有帮助。 |
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S****r
发帖数: 982 | 18 We performed a reporter assay on RAW cells days ago. The transfection
efficiency is fine, around 10-15% with EGFP. However, luciferase value is
extremely low, including both Firefly and Renilla that acts as the internal
control. I wonder if an activation is required for these cells, just like
handling in T cells that requires PMA and Ionomycin?
If it requires, what's concentration should I use?
Thanks in advance!
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S****r
发帖数: 982 | 19 Thanks! We tried in two other cell lines, both with similar transfection
efficiency, but still can see Renilla value from 200 to 1000, while in RAW
cells, it's only around 10.
I'm also not sure if RAW is tougher to be lysed in passive lysis buffer.
Should I try freezing-thawing cycle to disrupt them?
transfection |
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a*****i
发帖数: 1045 | 20 如果transfection的效率特别低，是不是测出来的值就不准确呢？
如果要比较两个transcription facotr, 谁activate那个特定的promoter 多一点。
但是其中有一个的transfection efficiency总是特别低，但是却发现这个
transcription factor可以更多的activate那个promoter。。。
我已经用了renilla luciferase作为检测transfection 效率的。
这种情况是什么意思呢？有没有懂得帮忙看看呢？
谢谢啦 |
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l******n
发帖数: 298 | 21 一个基因的dual luciferase assay, 刺激以后有10倍的激活，非常兴奋。从-2000一直
都砍到-100了，还是10倍的激活，一点也没减少，这是什么原因呢？
还有就是renilla-cmv好像也能被调控，有这么一说吗？
望高手指点 |
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b**********8
发帖数: 349 | 22 又来请教各位大侠了，
我最近发现对一株细胞做某种处理后，一个基因（暂命名为A）的mRNA和protein都显著
下调，结果已经重复多次。现在推测这种处理因素可能会影响细胞株中A基因的转录，
于是构建了一系列逐渐缩短的启动子报告基因（基于pGL3-basic载体）和renilla载体
一起转染细胞。双荧光素酶报告基因分析发现从转录起始位点上游1000bp处开始，一直
到上游150bp，跟对照处理相比，处理组细胞的报告基因的活性一直都有显著下降。见
图A所示。但是当把所有组的报告基因活性都先被对照组pGL3-promoter的活性
normalise后，统计分析却显示到上游200bp时报告基因的活性就没有差异了。两张
figure都是在grapad prism里面用two way anova做的统计分析，结果却截然不同，这
关系到我接下来具体分析哪一个区域的问题，请大家帮我看看，到底哪一种统计方法更
合理？谢谢 |
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t**********n
发帖数: 283 | 23 读数都是个位数或两位数，另外一个实验室的同事说他以前的读数都至少是几千上万的
。我们用的plate reader是BioTek的 Gen 5, reagents from Promega.
这正常么？ 哪个地方搞错了？ 非常感谢！ |
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m*********D
发帖数: 1727 | 24 没用过这种仪器。我们的仪器会有不同的setting: measure的时间往往会不一样的。 |
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t**********n
发帖数: 283 | 25 I followed the standard protocol of Promega kit.
Many thanks. |
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n***w
发帖数: 2405 | 26 For my positive control, I usually get 1000-2000 and the internal control is
about 5-10, so the ratio is always about 200ish.
My other experimental ones, which I didn't expect to have signals, would
give me values of single or double digits and the ratio ranges from 0.5 to 3
,4 ish...
So how about your control? The positive controls, both at your hand and his
should yield similar ratios. If this is okay, then you may not need to worry
much.
Even for negative results, we want interpretable negati... 阅读全帖 |
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h******y
发帖数: 55 | 27 这读数太低了，你转个psic heck-2做个正对照看看,至少要几万，🈶的时候一
百万都有 |
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L*******m
发帖数: 41 | 28 我觉得这个得看机器。
很久以前用过不同的两台机器，一个小于1000的书都不可信，一个两位数就很好。你看
看机器的背景读数多少 |
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t**********n
发帖数: 283 | 29 非常感谢Leaderham,以及上一帖的hellenny！ |
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F******p
发帖数: 2099 | 32 没转上，或者说<1%的efficiency.
luciferase这种report都是至少3位数基本的读数。 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 34 用了control gene没有？如dual-luc的reporters system，用sv40-renilla作internal
control? 一种现象是经常出现的，就是大量表达后出现的squeezing,解释就是
transcription factor不够用。这样，一个internal control会有一定的用处。但一般
用强的promoter, 如CMV等用来drive A或B的表达，当量达到一定水平时，你的
reporter基因的表达肯定会受影响。这种时候我们是不敢用这些数据的。 |
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发帖数: 1 | 35 研究noncoding序列，因为各种原因无法使用dual luciferase；所以想直接用single
luciferase（比如Renilla）
问题是，对于single luciferase应该如何对照才有说服力呢？翻了半天过去的文献都
没找到
我能想到的一个是细胞使用量，这个用GAPDH就可以control
还有一个就是转染的plasmid的量，这个我转染的时候保证同样molar的就是同样数量的
plasmid进入细胞；具体做法就是nanodrop测得plasmid的质量，然后除以分子量。请问
这样的做法大家买账吗？
谢谢 |
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