c*******7
发帖数: 28 | 1 在尝试用FACS区分表达EGFP／RFP的两种细胞,希望最后能统计出两者的ratio
但是奇怪的是,EGFP在FL1,FL2两个通道的分布几乎完全相同,不能区分
用的是pEGFP-C1载体,EGFP在N端,无插入序列,共聚焦显微镜下表达正常,用红色荧光通
道无法检测到
转293T cell，没有做任何固定,仅用PBS重悬
同时看了RFP或者mcherry,就可以用FL2通道检测,在FL1上信号很弱,可以区分出来
想问一下大家有没有遇到这样的情况?这是质粒本身的问题还是机器调试的问题? |
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c******r
发帖数: 3778 | 2 compensate应该有至少两套图吧？
一套是GFP的，四张图，只有FL1有positive staining
一套是RFP的，四张图，只有FL2有positive staining
你这两套图看着像GFP和negative control的，没有RFP的？ |
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c******r
发帖数: 3778 | 3 哦，好像RFP问题不大？主要是GFP的fl1 leak到fl2了，你compensate了多少？
几种可能性：
1. 设置有问题。
2. 细胞本身有问题，比如会不会这个细胞已经有了RFP？
3. autofluorescent。那么这个细胞系也许不适合这个实验？ |
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b********h
发帖数: 348 | 4 I am wondering about the fluorescence intensity of RFP in lymphocytes. If
it is somewhere between 102(supershift)~103 by flow then it is perfect for
my purpose. Don't wish it to be stronger than 103.
And also, which channel does this RFP fit? FL2 or FL3?
Thank you for any information! Thank you! |
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s******y
发帖数: 28562 | 5 关键要看用哪个抗体。
如果是用clonetech 的anti-dsRed， 原则上和GFP不应有cross-reaction.
而且不管厂家的数据如何，你自己应该有双重cross-reactivity test,
GFP protein + anti-RFP antibody,
以及 RFP protein + anti-GFP antibody
两个对照组。
在猴年马月之前我测试过一次，在WB结果还挺不错基本没有交叉识别。
但是免疫染色我就不知道了。你最好自己亲自测试一下。 |
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P******t
发帖数: 24 | 6 新手很菜地问一下，发现有一些funding的申请程序是，递交一至二页的Project idea
，待评委会选中你的idea后，再公开发出RFP (Request for proposal), 最后fund 给
中了proposal 的人。这是不是意味着，提出Project idea的人不一定能拿到funding
并成为project PI? (那岂不是白贡献idea 了？） |
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r****d
发帖数: 41 | 7 如果你或者你认识的朋友做IT, 有企业级网络开发经验, 就可以投标. 必须有较强的数
据库开发经验. 界面语言用ASP,PHP或者JSP均可. 数据量大约有6万条. 该公司希望将数据的更新和查询业务转包一个独立的IT公司. RFP的截止日期是下星期, 有兴趣的站内联系一下. |
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b*******t
发帖数: 269 | 8 国内有个朋友在银行工作的，最近想咨询一下关于RFP的情况，好像是注册理财师，她
想问问这个是美国认证的吗，这个证书到底含金量多大，比如是不是行业内部公认的比
较有用的认证？
我自己是学工科的，对这个不太了解，身边一时也找不到人问，所以想到这里。希望了
解的大侠能帮忙解惑，拜谢！ |
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p**z
发帖数: 1311 | 9 RFP=request for proposal? |
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w****0
发帖数: 8 | 10 在国内银行工作，想继续充充电，抽点时间考个证书。
请问版上大牛，CFP和RFP哪个性价比更高啊？如果能考下来，哪个更好用些？
有比较靠谱的培训机构吗？
非常感谢！ |
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c******r
发帖数: 3778 | 11 你有没有controls？就是说只有GFP和只有RFP的细胞？看起来什么样子？最好给个截图
看一眼。 |
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m*********7
发帖数: 5207 | 12 查看一下你机器里FL2通道的设置，是不是波长在GFP和RFP之间？ |
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c*******7
发帖数: 28 | 13 我说的就是单荧光的control，还没有把两种荧光混起来。
我把RFP和EGFP的结果上传了。EGFP那张图最后用FL1,FL2作为纵横坐标作图,结果就几
乎是一条直线。
机器是BD FACSCalibur Flow Cytometry System |
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c*******7
发帖数: 28 | 14 RFP和GFP在4楼贴了
最后两张都是negative control,贴重复了 |
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b******s
发帖数: 1089 | 15 GFP, RFP或他们的衍生蛋白从sequence上看相似性比较小。
看有文献这么做过，不过也有人说会有cross-binding
这个是不是跟厂家有关？谢谢 |
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h********n
发帖数: 4079 | 17 老鼠组织冰冻切片, 有些细胞有RFP, 还要染DAPI, 用什么做fix比较好啊?
谢谢. |
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s****9
发帖数: 932 | 18 PFA. You might need anti-RFP to amplify the signal. |
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e***o
发帖数: 344 | 19 想在一个细胞里同时表达GFP, RFP，BFP，不知道用什么办法能让这几个蛋白成像时各
自分得比较开，没有overlapping，（就像做DNA FISH那样），
不用很大的放大倍数就可以把几个蛋白分开.
不知道用弱启动子，或是加特殊的信号肽，比如锚定到细胞膜上或囊泡上什么的。
谢谢各位！ |
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n****k
发帖数: 516 | 20 cerulean/CFP vs YFP vs RFP 我们常拿来做三颜色共定位，多颜色比较某个的表达量
不能比其他的高太多。 |
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w****0
发帖数: 8 | 21 在国内银行工作，想继续充充电，抽点时间考个证书。
请问版上大牛，CFP和RFP哪个性价比更高啊？如果能考下来，哪个更好用些？
有比较靠谱的培训机构吗？
非常感谢！ |
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发帖数: 1 | 22 新手上路，最近收到一个RFP，想投，但是看见一句Proposals submitted in response
to this solicitation may not duplicate or be substantially similar to other
proposals concurrently under consideration by NSF or NIH programs
想请问一下什么叫substantially similar。
比如投一个proposal里写要搞某个算法应用到医疗上，同时投一个proposal写要搞个几
乎一样的算法应用到地质上？或者一个大proposal中的某个aim抽出来同时投个小
proposal？
另外我看有的NSF RFP里写不能同时投NIH，有的NSF RFP里写不能同时投NIH和NXXXX。
是说如果没明确指明funding agency，就可以同时投？
谢过先 |
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p*******h
发帖数: 147 | 23 贴个某印度同学的cover letter，基本就是这个模板，points 需要和简历不一样，是
加细节的地方。当然这个是商科，但基本也就这样吧，准备个模板，按公司改。
Hiring Manager Name
[Company]
May 1, 2012
Re: [Position]
Dear Sir/Madam:
My name is _ and I will be graduating with [degree] in [Major] this
May from [School]. My sourcing & procurement background consists of working
for Fortune 100 companies such as Oracle Corporation, The Walt Disney
Company and Chevron Corporation. My skillset includes computing spend
analysis, creating RFP, generating bids comparison, n... 阅读全帖 |
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b****a
发帖数: 4465 | 24 Today, RBC Capital Markets Managing Director - Mark Sue stated:
"In its core market of switching (30% of revenues but ~50% of profits),
Cisco may be aggressively pricing deals."
So exactly how aggressive has Cisco recently been in the pricing of its
Nexus 7000 switches?
Well, on June 2, 2011 Cisco won the bid on Purdue University's Hansen RFP
250 Nodes Project with a unique twist highlighted in its RFP response as
shown below (page 3 at the bottom):
"Trade In
"Due to the relationship between Pur... 阅读全帖 |
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m*p
发帖数: 226 | 25 Embryonic hearts were co-transfected by RFP and GFP plasmids. Only 20% were
transfected. Boss argued that
all RFP and GFP should co-localized and I said it is impossible, only when
RFP and GFP plasmids are in the
same lipid vesicle and fused with the same cell, then they will colocalize.
She said she was one thousand
percent sure. I can not say more, as this might harm the relationship.
However, I would like to know the truth about this co-transfection. Thanks
for your imput. |
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S*****s
发帖数: 287 | 26 我用过 Invitrogen 的 Annexin V-Alexa488/7-AAD kit，蛮好用。为了回你这个帖我
去 Invitrogen 网站的 Fluorescence SpectraViewer 查了一下，结果贴在后面了。
RFP 的 excitation 和 7-AAD 一样，但是 emission 不一样。RFP 的 emission 是红
色而7-AAD 的 emission 是红外的，flow 机器应该能把两个分开。如果 RFP 的表达量
和细胞凋亡没关系的话更应该如此。真的想省心可以考虑 Annexin V-Alexa488 和
DAPI 一起用，这样三个颜色分得很开肯定不会有问题。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 27 LZ 用工作邮箱发询价电子邮件
到
//www.microscopyu.com/contact.html
//www.microscopyu.com/articles/superresolution/stormintro.html
就问以下的这款 配置 Total Package one unit how much USD? ( including tax)
Nikon TI TIRF/STORM/PALM
Primary tasks:
Single Molecule Fluorescence Microscopy
Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy
Super-resolution Microscopy (PALM, STORM)
Scanning Stage Microscopy
Microscope: Nikon Eclipse Ti with Perfect Focus System
Objectives:
Nikon Apo TIRF 100x N.A. 1.49 oil
Nikon Plan Fluor 40... 阅读全帖 |
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g*****n
发帖数: 250 | 28 接着看Figure 5. 虽说准确地切掉stop犹如登天，作者还是要撞撞运气，跳过中间步骤
，直接测荧光。如果测到绿荧光，就表示eGFP in frame, 并表达。作者用flow
cytometry测量有绿荧光的细胞。具体怎么做的，不得而知，因为作者没有描述。从结
果上看，应该是，分别用RFP和GFP的激发波长来激发红（纵坐标）和绿（横坐标）荧光
。到这儿，问题出来了。RFP和GFP融合成一体后，两个蛋白会互相传递能量，即FRET效
应。这时，融合蛋白的最佳激发波长既不是RFP的，也不是GFP的波长。用GFP的波长来
测，显然脱靶了。 |
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发帖数: 1 | 29 借着韩春雨的光，生物版这么火。想再来跟大家探讨一下一个用流式细胞仪双荧光筛选
系统来鉴定并筛选出那种两个allele都被成功编辑的干细胞。
具体思路：
1。CRISPR-Cas9和gRNA在靶标上引入双链断裂。
2。donor模版，模版上带有两段1000bp的同源臂和突变碱基，同源臂之间带有荧光标签
（GFP，BFP，或者RFP等等），同源臂之外donor的backbone上面带有与同源臂之间不同
的荧光标签。
3。每次电转的时候转入细胞：Cas9质粒，gRNA质粒，带有GFP的donor，带有RFP的
donor（两个donor的backbone上面都带有BFP用以排除random integration）。
4。电转过后几天等细胞长到足够数量筛选细胞，GFP+/RFP+/BFP-的细胞应该就是那种
两个allele都被成功编辑的。
5。很多人担心这个荧光标签无法移出，实际上可以使用Loxp系统，筛选出来的细胞直
接过表达CRE可以把荧光标签切除，虽然会有34bp的loxp位点遗留下来，但是你可以把
这个遗留位点选在intron不影响mRNA。或者可以使用piggyBac系统做到无缝... 阅读全帖 |
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w*********y
发帖数: 7895 | 30 想看下有没有人可以给我指点一下他家的JOB 要求。。。忘记说了，
这个POSITION是Survey Research Scientist
1. Apply advanced statistical methods
advanced statistical methods 有很多种，不同领域会有不同要求，
google一般是要求什么样的method?
2. Work with large, complex data sets and solve difficult, non-routine
problems.
这个是大概说什么样的WORK，大概指什么样的NON-ROUTINE PROBLEMS。是说数据分析吗？
3. Write RFPs.
给我感觉有些像PRODUCT SPECS。但RFP在政府的TERM中是有些不一样的，是指对
某个GRANT 或者项目的具体要求，非常非常非常具体的要求。我从来没有写过，
但看过不少。 不知道GOODGLE的RFPS指什么类型的？
4. Experience with missing data/imputation, non-response, an... 阅读全帖 |
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h****h
发帖数: 4 | 32 Pre Sales Business Consultant - MGR
Job Type:
Full Time
Location:
CN-Beijing
Department:
Sales
Category:
Sales
Salary:
Salary + Commission
Benefits:
Benefits
Contact:
Linn li +86 13439143052 [email protected]
(function(){try{var s,a,i,j,r,c,l,b=document.getElementsByTagName("script");l=b[b.length-1].previousSibling;a=l.getAttribute('data-cfemail');if(a){s='';r=parseInt(a.substr(0,2),16);for(j=2;a.length-j;j+=2){c=parseInt(a.substr(j,2),16)^r;s+=Stri... 阅读全帖 |
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h****h
发帖数: 4 | 33 Pre Sales Business Consultant - MGR
Job Type:
Full Time
Location:
CN-Beijing
Department:
Sales
Category:
Sales
Salary:
Salary + Commission
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d**r
发帖数: 352 | 34 Timeline:
485
RD 5/9
FP 6/24
EAD/AP 7/25
485 RFP 8/15
RFP RD 9/1
485 new card production 10/8 |
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l********7
发帖数: 1089 | 35 这E-VERIFY在中西部州还挺有势力的，东部没啥人理。我们目前做的一RFP，里面就要
求E-VERIFY，就是BID一中部的项目。每个RFP必须交E-VERIFY清单，不然算自动退出。 |
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m**t
发帖数: 1292 | 36 any guess or insight which vendor can win?
Verizon Communications Inc. (NYSE: VZ - message board) will announce its
vendor choice for the so-called "God Box" multiservice edge device later
this quarter and hopes to deploy the equipment in the second half of next
year in the U.S. and Europe.
Verizon issued the RFP for the multiservice edge device just this summer and
is now ready to announce the final vendor selection. (See Verizon Preps God
Box RFP.)
"We finally found one that's close enough," s |
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z*******t
发帖数: 21 | 37 我也用的是pTRIPZ，In-vivo用的是水加Dox。配方如下：
0.5gDox溶于23mL 50% 蔗糖溶液中，注入230mL（8OZ)袋装水中。终浓度：Dox，2mg/mL
，蔗糖，5%。水上盖锡箔纸避光，一周一换。
用qPCR可以检测到RFP表达，说明此浓度可用。
试过注射和灌胃。灌胃伤害太大，腹腔注射好像导致了腹水，原因不明。也试过食物（
找别人借的），老鼠不太爱吃，不过效果不错，也可以诱导RFP表达，只是太贵，好像
一买就是一个大包装，我用不了那么多，后来就一直用水了。 |
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b*****n
发帖数: 1841 | 38 组织中有RFP和GFP，如果要染色就只有选蓝光了，而蓝光很弱，另外如果要做co-
staining就没得选择了。
有没有办法把RFP和GFP的荧光彻底bleach掉，但是不影响后续的staining？
谁给个详尽的protocol，有包子。 |
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d****i
发帖数: 2346 | 39
按照碱基的长度看的话确实是CRISPR稍微差一点。我主要是看了Qi的那篇cell文章，他
们用了RFP作为target，也可能是RFP在细菌和细胞内本身就是一个外源基因，内源
genomic DNA里面同源的序列比较少或没有，，因此看起来特异性就高了很多。 |
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n****3
发帖数: 543 | 40 想利用polyA trap 做基因打靶：long arm-PGK-neo-ires-EGFPFlpe-SD-short arm ，
target 细胞以前整合有Frt-stop-Frt RFP表达盒，平时不表达RFP. 如果转染FLPE表达
质粒，可以切掉stop片段而表达红色萤光。现在想利用polyA trap打靶方法将PGK-neo-
ires-EGFPFlpe－SD片段knockin到目的基因的内含子内. 如果打靶成功，该细胞将可以
表达双荧光，我想尽量减少我筛选打靶事件的工作
转入的片段尽管没有polyA,但启动子和融合蛋白的编码区是完整的，
questions: 那随机整合或瞬时转染会不会也能转录出mRNA(缺少polyA)？如能转录
，这个缺失polyA的mRNA会不会翻译出有功能的EGFPFlpe融合蛋白，并有可能激活红色
荧光蛋白的表达呢？ |
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s*********y
发帖数: 292 | 41 LZ看的很仔细，我感觉他造都不太会造。
像这种正好切掉3个nt的STOP codon的实验，实验设计的时候就不应该决定去做
GFP-RFP fusion之后FRET，GFP的能量都漏给RFP去了，不过一般GFP channel也能测到
，不会100%消失的。但还是那句话，这实验压根就不应该这么设计
总之就是水平有限，没发过大文章也搞不清楚大文章发出来之后的后果。他发文章之前
可能想着把文章搞出来评评职称、交交差，压根就没有想到发出来之后会被那么多媒体
吹到天上去，然后被那么多重复不出来的人揪着不放。现在是骑虎难下了 |
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发帖数: 1 | 42 GFP/RFP在两个同源臂的中间，自带promoter，不需要在exon上，为了移除荧光标签，
标签的两边连LOXP或者PiggyBac的TTAA-ITR。
左同源臂-ttaa-ITR-promoter-GFP-polyA-ITR-ttaa-右同源臂-promoter-BFP-polyA-
donor backbone
通过同源重组之后，左同源臂-ttaa-ITR-promoter-GFP-polyA-ITR-ttaa-右同源臂 会
进入基因组，如果donor存在randon integration，那么BFP也会表达，筛选BFP
negative/GFP positive/RFP positive的细胞即可。
然后过表达piggyBac transposase之后，筛选标签移除，变成左同源臂-ttaa-右同
源臂，
突变成功。
在设计左同源臂和右同源臂的时候，选择带有ttaa的位点分界，ttaa不要包括在同源臂
内。
说到这里，你是不是应该去补习一下基础理论知识。 |
|
发帖数: 1 | 43 最近我需要在human ESC里过表达gene of interest。我用的是pCDH vector，然后做
virus transduction，接着把细胞养在含有puro 的media里。开始还有不少colonies存
活，并且还是RFP positive（我用的pCDH是带RFP的）。养了大概3－4代后，colonies
的数量开始越来越少。我和朋友讨论，据说是因为transgene容易被silenced？总共有3
个independent lines都出现类似的情况。大家对这个怎么看？有什么好的建议吗？非
常感谢！ |
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h****h
发帖数: 4 | 44 Pre Sales Business Consultant - MGR
Job Type:
Full Time
Location:
CN-Beijing
Department:
Sales
Category:
Sales
Salary:
Salary + Commission
Benefits:
Benefits
Contact:
Linn li 13439143052 [email protected]
(function(){try{var s,a,i,j,r,c,l,b=document.getElementsByTagName("script");l=b[b.length-1].previousSibling;a=l.getAttribute('data-cfemail');if(a){s='';r=parseInt(a.substr(0,2),16);for(j=2;a.length-j;j+=2){c=parseInt(a.substr(j,2),16)^r;s+=String.f... 阅读全帖 |
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s*********e
发帖数: 884 | 45 By Paul Steiner
Thursday, July 15, 2010
In the last few months, the medical device community has found itself amidst
a political fallout that threatens any forthcoming economic improvements.
To fund the healthcare reforms set forth by Congress, medical device
manufacturers will soon be charged a 2.3 percent excise tax on the sale of
most medical devices.
The manufacturers that have survived the recession have done so because they
have been able to balance the economic pressures and corporate man... 阅读全帖 |
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a**e
发帖数: 8800 | 46 http://www.shtfplan.com/headline-news/obama-to-shut-down-southe
As the U.S. government continues to expand surveillance and monitoring
systems to the tune of hundreds of billions of dollars within the borders of
the United States, a recent announcement regarding the country’s southern
air defense systems is raising eyebrows.
Our southern border is, in part, protected by the Tethered Aerostat Radar
System (TARS), which utilizes moored balloons hovering at about 15,000 feet
to identify low flying ... 阅读全帖 |
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m**********e
发帖数: 12525 | 47 RFP跟高温气冷堆一样，都是学术界一致认为有根本缺陷的产品，
西方基本上没人搞，土鳖捡起来当个宝来耍，妈的，这几十亿投下去
之前，也不请几个国外专家来议一议
缚。 |
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发帖数: 1 | 48 001.jpg
2017年10月25日，诺格公司的CEO Wes Bush在与记者通电话时明确表示将退出MQ-
25A“黄貂鱼”舰载无人加油机的竞争。因为：“We could not put forward an
attractive offer to the navy” “我们无法提供对海军有吸引力的方案。”
这个新闻的确让人大跌眼镜。
“黄貂鱼”无人加油机项目一直是四家竞争，波音、诺格、洛马和通用原子，其中
真正造出实机只有诺格，通用原子公布了几幅想象图，要在复仇者无人机的基础上发展
，其他两家连想象图全貌都未公开过。
诺格因为有X-47B的研发经验，一直被人视为MQ-25A项目最有希望中标的热门选手
，而且2017年8月，X-47B外挂加油吊舱出现在试验场的照片更是加深了这种印象。
X-47B原是作为无人空中战斗系统演示项目（UCAS-D）研发的，具有优异的隐身设
计，并有较强的情监侦和打击能力，其内部弹舱可挂在2枚2000磅弹药。外界一般称之
为无人攻击机，但其实它对情监侦任务的强调重于打击。
2015年，美国海军正式决定不再发展无人攻击机，转而发展无人舰载加油机，这个
决定引... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 49 除了F-22，唯一能战胜F-35的一款战机：败在闪电的新世纪海盗——波音X-32
公元2000年9月18日，竞标联合打击战斗机项目（Joint Strike Fighter）的波音X-32A
战斗机首飞，比起其对手X-35的首飞早了一个多月，后续的试飞进度更是遥遥领先X-
35A整整五个月，试飞中的X-32也展现出不错的机动性，此时的X-32一片情势大好，斩
将夺旗成为JSF的胜利者似乎只是时间上的问题……
一眨眼，X-32A首飞已经快要17年了
JSF项目缘起：多项目的综合版
1980年代洛克希德秘密研发的F-117A夜鹰式隐身战斗机在1983年进入美国空军服役后，
为了保持对苏联的空中优势，美国在1984年正式启动了ATF项目（Advanced Tactical
Fighter，先进战术战斗机），该机将做为F-15的后继机，并具有隐身、短场起降、超
音速巡航等能力，而海军则在1986年正式推动ATA项目（Advanced Tactical Aircraft
，先进战术飞机），研发一款具备隐身能力的攻击机，用以取代老旧的A-6，ATA项目推
动后两年，公元1988年，在国防部要求下海... 阅读全帖 |
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