y*****n
发帖数: 45 | 1 我实验室博后要做一个microarray的实验需要提取一些动物组织的RNA，所以准备买
Qiagen的RNAlater保存液，然后Qiagen配套的装RNAlater保存液和组织的tube很贵，20
个5ml装的要两百多刀。那个博后嫌贵就不买这个贵的tube，就准备用那些很便宜的常
见的glass vials保存RNAlater液和组织。因为我是做bioinformatics的，不是很懂wet
lab,但还是有疑问，用那么便宜的glass vial能一样吗，我担心都已经做microarray
的实验了，如果因为省这个钱而实验失败的话就得不偿失了。 |
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c***y
发帖数: 615 | 2 最近接触RNAlator 处理过的样品,干得象木乃伊. 有人对RNAlator了解吗, 感觉如何?
下游RNA如何提取.我首先觉得homoginization就是个大问题.
多谢了 |
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c***y
发帖数: 615 | 3 最近接触RNAlator 处理过的样品,干得象木乃伊. 有人对RNAlator了解吗, 感觉如何?
下游RNA如何提取.我首先觉得homoginization就是个大问题.
多谢了 |
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a*****n
发帖数: 18 | 4 标本放在RNAlater(Ambion公司）中，-80度保存。请问还能用来提蛋白做WB吗,特别是
做磷酸化蛋白时? |
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a****d
发帖数: 1919 | 5 no worry about the regular glass vials. They should work.
I used both 15ml conical tube and eppendorf tube to store RNAlater bathed
tissue/cells at -20. no problem so far. |
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M*****e
发帖数: 279 | 6 我的办法可能能帮你解决问题.
我曾经试过多种办法提没有降解（用Bio-Rad or Agilent Bioanalyzer测integrity or
quality (RNA Integrity Number (RIN) by Agilent or RNA Quality Index (RQI)
by Bio-Rad)，不是仅仅用Nanodrop测RNA integrity or quality）的total RNA，然后
做microarray．
1.液氮研磨：RNA quality好，可以做microarray，但是麻烦和太慢（原因你应该知道
）。
２. Glass tissue homogenizer: it didn't work for me to grind tissue in
Trizol in ice bucket with ice, although my tissue was thin and tiny.
Bioanalyzer showed RNA degradation.It's also low through-put.
3. Hand-held electr... 阅读全帖 |
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M*****e
发帖数: 279 | 7 RNALater did not work for me when I extracted total RNA from my mouse (thin)
tissues that were snap frozen in liquid nitrogen, stored frozen, and ground or pulverized while it was frozen.
Without RNALater treatment and storage of mouse tissue in RNALater, I got
perfect total RNA from mouse tissues using the same RNA extraction method.
The quality of total RNA extracted from RNALater treated mouse tissues may
look good by NanoDrop. However, the quality is actually bad when it is
checked by Agilen... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 8 [回复] [回信给作者] [本篇全文] [本讨论区] [修改] [删除] [转寄] [转贴] [收藏]
[举报]
0
En 等 ManDate也去魔都开个千人级别以上的lab的时侯 两个可以好好切磋下RNA
later to be or not to be?
[ 14 ]
发信人: neverthink (nevernetbug), 信区: Biology
标 题: Re: 我的办法可能能帮你解决问题. 我反对用RNALater。
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Jun 16 17:52:42 2012, 美东)
不顶没天理呀！另外，你肯定是个好CO_WORKER!
不过，真的用的这样吗？我以前用了很多RNALATER提组织，从来没有出过什么问题，不
过我没用检查过RIN，也不是做去基因组的东西，你说的让我都想现在去提提试试，查
一下RIN；有没有谁用过RNALATER得到很好的RIN的冒个泡，或者是与LZ一样的，我有点
不敢相信的说
RIN |
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s******s
发帖数: 13035 | 9 ft, 都RNAlater了，基因表达还变个头啊。 RNAlater相当于fix了，
再变也就trypsin处理的时候变化2min，后面FACS完全无关 |
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n********k
发帖数: 2818 | 10 不顶没天理呀！另外，你肯定是个好CO_WORKER!
不过，真的用的这样吗？我以前用了很多RNALATER提组织，从来没有出过什么问题，不
过我没用检查过RIN，也不是做去基因组的东西，你说的让我都想现在去提提试试，查
一下RIN；有没有谁用过RNALATER得到很好的RIN的冒个泡，或者是与LZ一样的，我有点
不敢相信的说
RIN |
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h********n
发帖数: 4079 | 11 那个大概是盐的结晶. 把组织从RNAlater里面拿出来, 用Trizol提, 应该没有问题. 我
用这个办法提了很多老鼠的肺. |
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f******s
发帖数: 115 | 12 可是qiagen说明书有这么一句话：
6. After storage, purify RNA using a QIAGEN kit (see Table 1, page 8).
Be sure to remove tissues from RNAlater RNA Stabilization Reagent prior to
disruption and homogenization in the RNA purification procedure. If tissues
were stored at –20°C, remove any crystals that may have formed.
他们说的”remove any crystals that may have formed“到底是往哪里remove是要还
是不要？而还有个问题，sample在rna later中放置久了会不会造成sample丢失？ |
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h********n
发帖数: 4079 | 13 就是把泡在RNAlater里的组织取出来, 用RNase free的水稍微洗几秒, 然后按照常规提
RNA的方法. |
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h********n
发帖数: 4079 | 17 按照protocol上说的, 如果厚度超过xxx(具体多少忘了), 可以把组织切小一点.
就渗透来说, 足够长的时间以后肯定没问题. |
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F*****e
发帖数: 182 | 24 准备从wildtype和mutant的老鼠里取mouse tissue，提取total RNA后做mRNA seqencing。
在犹豫是用Trizol还是Qiagen RNeasy Protect Mini Kit，因为需要先取胚胎，然后
PCR鉴定genotype，之后才能决定需要做哪个，因此最好能将tissue保存一段时间。
Qiagen的kit里面有一个RNAlater RNA Stabilization Reagent，号称tissue放在里面
可以4度保存4周而RNA不被降解，真的这么安全么？有没有用过这个kit的朋友。
另外mRNA sequencing给的结果到底有多可信？定量分析怎么样？多谢。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 25 Trizol肯定work, 那个kit没用过，估计也不会有问题，
抽RNA属于比较简单的活。
那个RNAlater据说很牛，没用过。Seq结果啥叫有多可信？
bias肯定有，基本和realtime一致
seqencing。 |
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F*****e
发帖数: 182 | 26 genotype最快也得2-3个小时吧，把胚胎的尾巴拿来用NaOH煮一下，Tris-HCl中和以后
离心取上清
直接做PCR，PCR run一个半小时，跑胶20min。
今天听说Ambion也有一个RNAlater solution，把tissue放在里面很稳定，据说很牛。
我们就是想看看mutant里面哪些基因的RNA水平有变化，然后跟phenotype联系起来好找
mechanism
啊。
做library的话facility用的是illumina mRNA sequencing sample preparation kit，
两天完成library，似乎不用花太大力气。有没有做过的朋友？ |
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D******t
发帖数: 79 | 27 RNAlater works good for me, although some people started to argue against it
.
For mRNA Deep sequencing, I extracted the 200bp band and purify the band
myself. It works good. |
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s******r
发帖数: 2876 | 28 提RNA的kit不贵，你完全可以全部都提，
等genotype结果出来吧不要的扔掉。
准备从wildtype和mutant的老鼠里取mouse tissue，提取total RNA后做mRNA
seqencing。
在犹豫是用Trizol还是Qiagen RNeasy Protect Mini Kit，因为需要先取胚胎，然后
PCR鉴定genotype，之后才能决定需要做哪个，因此最好能将tissue保存一段时间。
Qiagen的kit里面有一个RNAlater RNA Stabilization Reagent，号称tissue放在里面
可以4度保存4周而RNA不被降解，真的这么安全么？有没有用过这个kit的朋友。
另外mRNA sequencing给的结果到底有多可信？定量分析怎么样？多谢。 |
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c********d
发帖数: 75 | 29 RLT里头记得要有fresh 2-ME，sorting过程中RLT用4度水浴,sorting完了如果不是马上提
rna，转移过程中管子要放dry ice上然后-80度保存。提rna时快速室温水浴解冻，注意
观察冰块一
旦快融尽，迅速转移到冰上操作。提出的rna取两三个微升做质检，剩下的就赶紧冻起
来，运输过程也
都保证冰冻状态。总之尽量保证全过程的低温和快速。
用RNAlater对低温的要求不高，就是多一步离心，会有一些细胞的损失。两万细胞剩下
的应该也够做
一个chip了。 |
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M*****n
发帖数: 16729 | 31 use RNAlater to preserve the samples？ |
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n********k
发帖数: 2818 | 32 more buffer and complete and fast lysis will do it...For a beginner, do
yourself a favor and NEVER try to save on buffer---the key is complete
lysis with enough buffer...then it can last fairly long, as long as it is fully lysed, no worry about RNase until the column step...if in doubt, use
RNAlater...it is fantastic...
RLT |
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s******s
发帖数: 13035 | 33 貌似RNAlater能够先处理再FACS，你出查查manual, 这样应该
就没问题了。
另外， seq吧。array落伍了。 |
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c****1
发帖数: 1095 | 34 请教做乙酰化的专家：
1. 通常的乙酰化的抗体，都是用一个短肽做免疫原。比如，一个用来做K9ac抗体的短
肽，是4-15的序列，但是这个序列中，K9是ac修饰的，但是还有其他没有修饰的K，比
如K5，K12。我的问题是，这个抗体，是不是只能识别K9乙酰化，同时K5和K12没有修饰
的序列？这样一来的话，这个抗体，并没有识别所有的K9乙酰化的状态。好像还没有那
个paper提到这个情况。
2. 乙酰化修饰是否稳定？去乙酰化需要能量么？在RNAlater中解剖组织对乙酰化修饰
有没有什么影响？
非常感谢！！！ |
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s******y
发帖数: 28562 | 35
取决于具体的抗体，有的是可以识别所有的acetyl-lysine，有的则对背景序列
也敏感
一般比较稳定。
去乙酰化不需要能量，但是需要酶催化才能高效。
RNAlater具体是什么成分？如果不是碱性很强， 应该问题不大。 |
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c****1
发帖数: 1095 | 36 非常感谢！！
抗体的问题，如果写paper，reviewer问到，改如何argue呢？对背景序列是否敏感，貌
似不好检测啊。我觉得，唯一的方法就是用同时应用不同公司的抗体，看是否有相同的
结果。
RNAlater是一种RNA稳定剂，主要用于RNA的提取，具体成分不详，作用机理就是让所有
蛋白变性。 |
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c***y
发帖数: 615 | 38 多谢回复.那怎样homoginize样品的? 是肌肉组织 |
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I***a
发帖数: 13467 | 39 polytron homogenizer,
不过我用得不是很理想，之后还用了beads，再打一遍。 |
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c***y
发帖数: 615 | 41 你的RNA quality and yield 如何? 多谢 |
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I***a
发帖数: 13467 | 42 除了260／230 ratio不稳定外，其它都不错，
没找出原因在哪？ |
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c***y
发帖数: 615 | 43 能详细讲讲你处理的是什么样品吗?具体homogenizing step.
多谢 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 44 前几天去三藩开会，看到cayman有个新产品，叫做precellys 24.号称高通量快速裂解
样品，不损失dna,rna and protein.这个机器用陶瓷珠子在几秒钟内粉碎样品。可能贵
了点，大概机器要一万刀？ |
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c****1
发帖数: 1095 | 46 好贴留名。
顺便问问，有用RNAlater dissection sample，然后做western的么？
我试过，好像没有问题。 |
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n********k
发帖数: 2818 | 47 In principle, RNAlater will pretty much inhibit everything, so it shall be
good for protein, RNA and DNA...but I never tried on protein or DNA... |
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j****x
发帖数: 1704 | 48 保存在RNAlater里的几组细胞样本，需要尽快送回国内，最理想是能特快一个干冰包装
回去，不知道诸位有没有经验，请提点一下。多谢！ |
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a********k
发帖数: 2273 | 49 RNAlater里面就无所谓了，搞个普通冰袋就行了。
如果是RNA的话用干冰也能送回国，不过Fedex很贵很贵。。。 |
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