m****n
发帖数: 1066 | 1 Blood plasma is extremely high in ribonuclease (RNase) activity, and
minimizing this activity is critical to any blood RNA isolation procedure.
Naked siRNA will be degraded.
Chemically modified siRNA has better stability. |
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m*********D
发帖数: 1727 | 2 能不能in vitro translation合成S-35标记你的蛋白，然后把这个蛋白和你感兴趣的细
胞里分离纯化出来total RNA混合（注意buffer,pH），上Electrophoretic mobility
shift assay（EMSA)gel,比较有RNA和没有RNA的lane上条带的变化。还可以再有一个蛋
白-RNA-RNase的lane作比较。应该可以证明你的蛋白是不是和RNA结合。 |
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j******n
发帖数: 941 | 3 RNA protection assay.
Crosslink, then RNase digest, then qPCR or other |
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m***i
发帖数: 166 | 4 这个是最靠谱的。要跑SDS-PAGE，再转上nitrocellulose，然后曝光用phosphoimager
看。用高浓度RNase，这样如果看到的条带是和protein MW差不多就是了。negative
ctrl用IgG和没有UV x-link |
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m******u
发帖数: 12400 | 5 问题不但有点多，还问得不清楚。
我也不懂，就知道“想用inhibitor处理植物抑制磷酸化”---有许多kinase抑制剂，但
不知你问得是不是kinase抑制剂。你如果你问的不是抑制蛋白磷酸化的，那我只有说不
知道了。
应该没有抑制mRNA降解的inhibitor，但有抑制RNase的东东叫RNasin，不知是不是你想
问的。 |
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M*****n
发帖数: 16729 | 6 问问大家这些column是不是RNAse free的？
我们要经常做RNA in vitro synthesis，需要用column来clean up DNA template.
大家有没有用的比较好的column (必须是 RNAase free)
thanks. |
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s******s
发帖数: 13035 | 7 柱子多数应该没问题把，倒是buffer可能问题大点。
你不放心的话，最后的wash和elute自己用RNAse free的水配
一下，有点残留也该洗掉了 |
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B******o
发帖数: 496 | 8 Totally different mechanisms. The most common mechanism for ASNs is through
RNase H-mediated degradation of target mRNAs while siRNAs act through Ago2-
mediated cleavage of target mRNAs. |
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c*z
发帖数: 157 | 9 是的，公司多数用Qubit测浓度，可以比nanodrop低一半，但是100倍的话，估计是进了
rnase....
我觉得lz的东西是被降解了，新鲜组织rna质量不会太差的
illumina在aacr present了 fixed tissue RNA seq, 只要QC出来80%的RNA大于200nt就
可以 |
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L****T
发帖数: 169 | 11 你咋测定质粒浓度的？如果像你描述这样电泳结果，很可能大部分EB被前面的RNA结合
了，说不定你质粒的量其实还可以。另外肯定一点你大抽Kit的RNase不足。 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 12 Isolation of nuclei for the co-IP and whole ChIP protocols is based on the
methods of Gendrel et al. (2002, 2005), Johnson et al. (2002), and Nelson et
al. (2006).
METHOD
For extraction and co-IP of nuclear proteins, see Steps 1-39 (Fig. 1). For
the ChIP procedure, see Steps 40-69 (Fig. 2).
Figure 1.
View larger version:
In this page
In a new window
Figure 1.
Flowchart for the timeline and organization for co-IP of nuclear proteins
from Arabidopsis seedlings.
Figure 2.
View larger versio... 阅读全帖 |
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i***l
发帖数: 1656 | 13 if for eukaryote expression,
buy T7, NTP, RNase inhibitor, mGTP, and save more
reactions |
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K**4
发帖数: 1015 | 15 RNaseA聚集在那了，说明那里有targets；subnuclear body，比如spliceosomal small
nuclear ribonucleoproteins (RNPs), small nucleolar RNPs，本身含有很多RNAs，
至于进一步的解释，需要具体问题具体分析了。 |
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O********4
发帖数: 113 | 16 很容易，随机引物RT, 再用<—和—> 的引物做PCR. 讲究些的要用RNase R 处理一下去
掉artifact. |
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O********4
发帖数: 113 | 17 看来你不常做分子生物学。RT的产物不需要nick repair 或ligation啊，就像通常做就
可以了。RT 的产物是linear DNA的，只不过跨过circRNA特有的splice Junction. 比
如你用一个基因里反向的引物做PCR， linear mRNA 就没产物，而circular RNA 才会
有产物， 再一测序发现你的产物上exon 4连到exon 3 的5' end 了，这就证明了是环
状。
<- ->
－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－
还有你可以用外切酶RNase R 处理一下，线性的RNA被降解而环状不降解。
最早发现circRNA 的是通过90年代开始大规模测EST （那时还没有RNA-seq ) ， 发现
许多mRNA 的exon order 反了, 这不是由于trans-splicing 就是由于 back splicing
，结果这两种splicing方式都存在。还有circRNA 是可以被翻译成protein 的，所以也
不能说它纯粹是非编码，呵呵。 |
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s**********a
发帖数: 92 | 18 我们做CHIP 用的是 milippore kit.
按照他们的protocol是这样分离蛋白和DNA的：
E. Reverse Crosslinks of Protein/DNA Complexes to Free DNA
1. To all tubes (IPs and Inputs) add 8μl 5M NaCl and incubate at 65°C for
4-5 hours or overnight to reverse the DNA – Protein crosslinks. After this
step the sample can be stored at -20°C and the protocol continued the next
day.
2. To all tubes, add 1μl of RNase A and incubate for 30 minutes at 37°C.
3. Add 4μl 0.5M EDTA, 8μl 1M Tris-HCl and 1μl Proteinase K and incubate
at 45°C for 1... 阅读全帖 |
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x*****d
发帖数: 704 | 19
实验台上吃饭不仅危险，而且一大堆RNAse污染，还做啥实验呢。 |
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v********a
发帖数: 646 | 20 想做RNA/Protein的共定位
用ISH检测RNA,其中有一步是蛋白酶消化；
用IHC定位蛋白质, 其中有一步可能用到RNAse A消化；
请问哪位可以提供一个reliable的protocol，可以兼容RNA FISH/Protein IHC, 以此可
以看到RNA-Protein的co－locatization？
谢谢！ |
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g*****n
发帖数: 250 | 21 先做ISH, 不用蛋白酶。RNase不会影响IHC. |
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v********a
发帖数: 646 | 22 想做RNA/Protein的共定位
用ISH检测RNA,其中有一步是蛋白酶消化；
用IHC定位蛋白质, 其中有一步可能用到RNAse A消化；
请问哪位可以提供一个reliable的protocol，可以兼容RNA FISH/Protein IHC, 以此可
以看到RNA-Protein的co－locatization？
谢谢！ |
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g*****n
发帖数: 250 | 23 先做ISH, 不用蛋白酶。RNase不会影响IHC. |
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p******g
发帖数: 498 | 25 实际TracrRNA的发现已经奠定了CRISPR作为genome editing的基础。张峰的CRISPR系统
早期工作正是基于这个基础。如果你仔细读一下张峰的第一篇CRISPR文章，你就可以发
现张峰是完完全全模拟了细菌中的四个components，连RNase都加了。他的错误是没有
及时发表。等JD和Charpentier的science文章出来，他还比较了一下两个系统，就被
Church实验室赶上了。
机理在charpentier实验室发现TracrRNA后已经清楚了。2012 JD和Charpentier的文章
并非独一无二， Siksnys实验室差不多同时也发了差不多的结果。http://www.pnas.org/content/109/39/E2579 |
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p******g
发帖数: 498 | 26 CRISPR系统的主要组件，包括Cas9，crRNA 和 TracrRNA等,被发现后，由于系统的简单
性，成为下一代genome-editing tool只是时间问题。正如DNA双螺旋模型提出前夜，时
机已经成熟，就看谁是那个幸运儿。
张锋就是这个CRISPR的幸运儿。
张锋在2011年初就开始着手尝试用CRISPR系统在人细胞中编辑基因。此时Charpentier
实验室刚刚将CRISPR系统的最后一个关键组件tracrRNA发表。2012年初（这个时间点不
太确定，可能更早）张锋实验室已经成功地在人细胞中编辑了基因。如果仔细读一下张
锋的第一篇CRISPR文章，可以发
现他们是完完全全模拟了细菌中的四个组件，连RNase都加了。然而，当时他并没有立
即发表文章，也没有申请专利。这也导致了以后他的尴尬。因为2012年五月
Charpentier and Doudna发表了在离体及细菌中的基因编辑工作。张锋同学居然还没有
着急，施施然比较了Charpentier Doudna用的两组件系统。这时全世界的同志们都扑上
来了。不过好在当时美国专利局还是采用的谁先发明，谁得专利。这个就给了... 阅读全帖 |
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p******g
发帖数: 498 | 27 CRISPR系统的主要组件，包括Cas9，crRNA 和 TracrRNA等,被发现后，由于系统的简单
性，成为下一代genome-editing tool只是时间问题。正如DNA双螺旋模型提出前夜，时
机已经成熟，就看谁是那个幸运儿。
张锋就是这个CRISPR的幸运儿。
张锋在2011年初就开始着手尝试用CRISPR系统在人细胞中编辑基因。此时Charpentier
实验室刚刚将CRISPR系统的最后一个关键组件tracrRNA发表。2012年初（这个时间点不
太确定，可能更早）张锋实验室已经成功地在人细胞中编辑了基因。如果仔细读一下张
锋的第一篇CRISPR文章，可以发
现他们是完完全全模拟了细菌中的四个组件，连RNase都加了。然而，当时他并没有立
即发表文章，也没有申请专利。这也导致了以后他的尴尬。因为2012年五月
Charpentier and Doudna发表了在离体及细菌中的基因编辑工作。张锋同学居然还没有
着急，施施然比较了Charpentier Doudna用的两组件系统。这时全世界的同志们都扑上
来了。不过好在当时美国专利局还是采用的谁先发明，谁得专利。这个就给了... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 30 #注明译者，请随便转载：）
CRISPR英雄谱
埃里克・兰德（Eric Lander）
小鹿／译
三年之前，科学家们宣布，CRISPR技术能够对真核活细胞进行精准与有效的基因组编辑
。自此，这项技术手段已然震撼了科学界，数以千计的实验室正在将其运用于从生物医
药到农业的各个领域。然而，从一种奇特的细菌重复序列现象的发现开始，到确认这种
现象为适应性免疫系统，进而对它的生物功能特性的了解，直至开发为一项基因工程的
技术，这此前二十载相关的研究历程却不为人所知。本文正是着眼于填补这段科学历史
的空白，它讲述的是观念的演化历史和先锋人物的传奇故事，并且从中获得关于支撑科
学发现的优秀科研环境的启迪。
前言
很难想起曾经有哪一次科学革命像CRISPR这般如此迅速地改变生物学界。仅仅三年之前
，科学家宣布，CRISPR系统，即细菌通过纪录和精准攻击入侵病毒的DNA序列而进行自
身防御的适应性免疫系统，可以利用转化为一项简单而有效的技术在哺乳动物和其它生
物体的活体细胞内进行基因组编辑。CRISPR即此被全球数以千计的实验室运用于广泛的
领域，如创建人类遗传疾病和癌症的复杂动物模型；... 阅读全帖 |
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c*********r
发帖数: 1312 | 31 如果做IP之后提取RNA做RNA-seq的话，是不是IP的每一步都要加RNase inhibitor？求
一些成熟的protocol和相关文章、资料。
计划做一个side project，看看目标蛋白都结合哪些RNA。 谢谢！ |
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R****n
发帖数: 708 | 32 今天简单一下，虽然不好看，但是意思出来了，似乎核有点结块问题不大。见图，还有
几个问题。
1）我准备后续做southern,MNase处理后，要不要加RNase A 和 proteinase K,原有
MNase buffer行不行？因为lane 2-5，band之间有smear.
2) 1%的胶跑出去了，理想是多大浓度？
非常感谢！
5- |
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s******y
发帖数: 28562 | 33 可是我们经常拿来做内参的tRNA也是有结构的呀，碰到RNase一样死得很快啊。
如果你放在一个超级干净的管子里当然没有问题，但是不就是怕污染么？但是DNA
oligo 就没有这个问题。放一个星期的说法我还是为了谨慎而这么说的，其实放几年都
没有问题。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 34 说是怎么说，当年我天天提mRNA做实验的时候旁边的人咳一声我都能被吓个半死，不就
是怕空气中的微粒么？而且很多第三世界国家的实验室没有美国这样的过滤空气装置，
有些甚至是开着窗户做实验的，所以对于他们而言还是有区别的。
另外，细胞培养的时候血清里本来就含RNase的，我不知道你们做RNP瞬转的时候需不需
要额外的把细胞多清洗几次把血清彻底洗干净？还是无所谓？ |
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c*****g
发帖数: 66 | 35 RNase H 可以，不过你需要设计DNA来和RNA杂交 |
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发帖数: 1 | 36 IP，加或不加RNase，RT-qPCR
RIP，WB
FISH+抗体染色。
三个实验如果能共同证明一个问题，得证。
[在 iseeyou1210 (iseeyou1210) 的大作中提到：]
:目前猜测某蛋白是RNA结合蛋白，如何初步确定这个假设。
:多谢！ |
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l********e
发帖数: 415 | 37 这些都有直接或间接的问题。最好加上RNA gel shift
: IP，加或不加RNase，RT-qPCR
: RIP，WB
: FISH 抗体染色。
: 三个实验如果能共同证明一个问题，得证。
: [在 iseeyou1210 (iseeyou1210) 的大作中提到：]
: :目前猜测某蛋白是RNA结合蛋白，如何初步确定这个假设。
: :多谢！
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发帖数: 1 | 38 能力不行，没有发现RNAse的活性，却造假说有DNAse活性。
的。 |
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l*******k
发帖数: 63 | 39 我从sigma买了两次不同纯度的RNase A，一个是纯度>60%,还有一个是>90%，结果不论
是western还是质谱都检测不到这个蛋白，这算是说明sigma经常卖假货吗？ |
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f*******e
发帖数: 354 | 40 你确定你买了真的sigma
: 我从sigma买了两次不同纯度的RNase A，一个是纯度 |
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e****n
发帖数: 165 | 41 请问有什么便宜或常用的蛋白的isoelectric point 是5 或者9的？除了BSA,
lactoglobulin,(pI=5), Rnase A(9). |
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d********w
发帖数: 1110 | 42 I got this from a recruiter, so please directly contact him for this
position.
------------------------------------------------------------------------
Hi XX,
Hope you are doing fine. Per my message, please let me know if you are
interested in a long term contract opportunity for a Research Scientist
position with my client Agilent located in Santa Clara, CA (zip code: 95051)
. Please see job description below and feel free to call me at 408-800-4496
to discuss.
Job Description for Research Sci... 阅读全帖 |
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t******9
发帖数: 270 | 43 来自主题: MedicalCareer版 - 关于CRC 又有网友问CRC的job responsibility。一言难尽，可以说除了和clinical management
无关的任何杂事你都必须去做。比如，你手上分到了一个clinical trial，你要熟悉其
中的大部分内容，尤其首先要熟悉screening criteria。然后等医生发现他／她的病人
可能符合这项clinical trial的要求，你就去见病人，向他用他懂的话解释这个
clinical trial是做什么的，医生和ＲＮ都解释过了重点，你就是解释一下具体的
schedule。来几次，抽血、活检，等具体事项。然后你根据trial的要求，给病人预约
好他的就诊时间。你要问病人的过去就诊地点要他的病历。等病人来了，抽血你管送，
管收藏到冰箱，管邮寄出去到其他地方。我还管活检标本到病理实验室之前的所有初步处理，为了保证高质量的标本。什么没有RNase污染，快速冷冻之类的。这也是他们要我的一个重要原因之一。病人给你发邮件，任何和医学相关的东西你要
转发给医生和ＲＮ，任何和医学无关的问题你要管回答。管协调。病人的研究数据你要
管登录到数据库里面，每６个月要看数据库数据全不全。病人... 阅读全帖 |
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