l**********1
发帖数: 5204 | 1 OMG
LZ used degenerated primer for cDNA single strand synthesis
R U Seriously? an amateur molecular biologist LZ?
Please go to
//www.protocol-
online.org/prot/Molecular_Biology/RNA/Reverse_Transcription__RT____cDNA_Synthesis/index.html
RT reaction is also called first strand cDNA synthesis. Three types of primers can be used for RT reaction:
oligo (dT) primers, random (hexamer) primers and gene specific primers with each having its pros and cons.
or
/media.affymetrix.com/support/technical/usb... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 2 from his/her sentence
>做realtime RTPCR， 自己上网设计的引物 mRNA as template 用one step RTPCR, then 自己上网设计的引物 PCR
竟
然一点不能得到产物
but with direct genomic DNA as template 自己上网设计的引物 可以得到很干净的条带
then you can IMAGE that---
because he/she did not have the full 3' UTR end that target full sequence information
so he/she used degenerated primer+oligo T tails for one-step qRTPCR
otherwise without below his/her 0F paste.
---- |
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m***o
发帖数: 272 | 3 有什么原因吗？
做realtime RTPCR， 自己上网设计的引物如果用one step,竟然一点不能得到产物，但
如果仅用来做PCR，就可以得到很干净的条带。所以想在one step 里加random primer
来RT，但是好像很多kit都是只用gene 的primer来RT。不知有啥讲究。
谢谢！ |
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M****e
发帖数: 70 | 4 if you are look at splicing events and you definitely would
like to use northern blot, though technically it might be
difficult. RTPCR is more sensitive for quantitation of total
messages, or you can actually design primers for alternative
splicing products to specifically measure them in a total
population of mRNAs. i like RTPCR since it is quick to roughly
estimate changes for steady level of RNA. and sometimes i do
semiquantitative RTPCR, which means that i stop the RXN before
it reaches the |
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s***d
发帖数: 15421 | 5 冬天吃狗肉是湖北湖南广西云贵的传统啊。
某一线钱佬微信纪录
武汉的病毒性肺炎，看rtpcr的数据和体外实验，只知道在狗的细胞里可以完整复制后
，可以非接触空气传播人和狗，在人的细胞中不完全复制，所以不人传人也叫有限人传
人，也就是说发病的人无法传染，携带病毒的可以传染，所以被他传染的无法再传染他
人，最近千万不要虐狗，接触狗的过程很高概率被传染。香港和武汉的RTPCR数据完全
不同。香港是流感有神经氨酸酶位点。武汉是冠状病毒。没有氨酸酶表达，武汉这个不
可以人传染人，狗和狗的传播。可以鸟媒或者人媒，可能眼部接触飞沫传染。不过狗传
染人只能空气和接触，新型冠状病毒的基因组序列已保存在 GenBank（登录号为
MN908947）上，可随时下载、共享及分析此数据。
下载链接：
http://virological.org/t/initial-genome-release-of-novel-coronavirus/319?from=timeline |
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n*******e
发帖数: 27 | 6 yeap, man, it is like that you first have to make a DNA
competitor that can be amplified with the same primer
sets. however, the size of the product is different than
the RTPCR product, normally it is 30-100bp less than
that. so it is an internal deletion of the RTPCR product.
then you add different amount of the competitor to the
RT product, and do PCR. run the gel through a machine,
sort of like HPLC. there should be three major products,
the cDNA, the truncated cDNA, as well as a hybrid of
th |
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r******g
发帖数: 600 | 7 没有问题啊
Null Hypothesis 是 1：19啊
（通俗的解释啊）
你的结果是11：89，P value＝0.05的意思是，在null hypothesis基础上只有5%的概率
得到比11：89的情况更extreme的结果啊！所以，你的实验结果是阳性啊啊，换句话说
，你的实验结果跟1：19不一样！
所以，在1：19的背景下，想得到11：89的结果已经是难上加难了，如果想得到30：70
就更难了，只有1%可能得到比30：70更extreme的结果！所以，非常非常不可能，也就
是说，原来1：19的null hypothesis被你的数据推翻了，于是，你的结果是阳性的！
比如，你做一个 RTPCR，control RQ value是 1，1.2, 1.3
实验组 结果是 89, 90, 100.
做这个rtpcr之前，你是不知道结果的，所以你的null hypothesis是，control=
experimtal
显然，你这个结果情况下P value会很低了，因为，基于你的null hypothesis 出现89.
90，100的概率太低了，所以，你的Pvalue很低... 阅读全帖 |
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r******g
发帖数: 600 | 8 没有问题啊
Null Hypothesis 是 1：19啊
（通俗的解释啊）
你的结果是11：89，P value＝0.05的意思是，在null hypothesis基础上只有5%的概率
得到比11：89的情况更extreme的结果啊！所以，你的实验结果是阳性啊啊，换句话说
，你的实验结果跟1：19不一样！
所以，在1：19的背景下，想得到11：89的结果已经是难上加难了，如果想得到30：70
就更难了，只有1%可能得到比30：70更extreme的结果！所以，非常非常不可能，也就
是说，原来1：19的null hypothesis被你的数据推翻了，于是，你的结果是阳性的！
比如，你做一个 RTPCR，control RQ value是 1，1.2, 1.3
实验组 结果是 89, 90, 100.
做这个rtpcr之前，你是不知道结果的，所以你的null hypothesis是，control=
experimtal
显然，你这个结果情况下P value会很低了，因为，基于你的null hypothesis 出现89.
90，100的概率太低了，所以，你的Pvalue很低... 阅读全帖 |
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v*******n
发帖数: 8995 | 10 胡说八道
来个猴子 哥三天也教会丫怎么rtpcr了
★ 发自iPhone App: ChinaWeb 1.1.5 |
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x********e
发帖数: 35261 | 11 我那天跟老公因为这个还小吵了一架 lol
我觉得没用。有意义的是rtPCR。但最大的限制其实是试剂盒。试剂盒要冷链，采样提
dna/rna需要专业训练。关键普通人不会把所有病原体的试剂盒都囤个遍。还不如搞
mNGS呢 |
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x********e
发帖数: 35261 | 12 统一回复你和某些喷子吧，仔仔细细去NEJM看看美国第一例患者的检测结果。仔细看各
个timepoint的Ct值。你就知道为什么RTPCR做不出来了。 |
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x********e
发帖数: 35261 | 13 titer问题，本来rtPCR就不容易重复，严重依赖copy number。飞沫传播存在不等于咽
拭子阴性的人能飞沫传播，更不等于飞沫传播的那点病毒能够被测出。
我还说电镜能看到病毒呢，你能给每个疑似照照电镜？ |
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x********e
发帖数: 35261 | 14 得p3实验室做，要不然我自己花一万买个二手RTPCR仪器，很快就回本了。 |
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x********e
发帖数: 35261 | 15 rtPCR很难假阳性的。德国cdc直接搞了个SARS和新冠通用试剂盒，没任何问题。试剂盒
都是需要提供灵敏度和准确度数据的。美国要是有问题，那就高度指向不是假阳性，美
国就是多种冠状病毒流行中。 |
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h*****s
发帖数: 733 | 16 那就是美国是发源地了。
：rtPCR很难假阳性的。德国cdc直接搞了个SARS和新冠通用试剂盒，没任何问题。试剂
盒都是需要提供灵敏度和准确度数据的。美国要是有问题，那就高度指向不是假阳性，
美国就是多种冠状病毒流行中。
：【 在 airglacier (带娃先锋) 的大作中提到: 】 |
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x********e
发帖数: 35261 | 17 武汉用ct诊断，比rtPCR更牛逼。美国更学不来 |
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x********e
发帖数: 35261 | 18 中国的问题是，物廉价美的东西多山寨垃圾也多。没点水平或者没点关系采购中国的产
品，八成要掉坑里。另外，RNA extraction kit和rtPCR kit好不好用跟谁来用也有关
系。 |
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x********e
发帖数: 35261 | 19 床旁检测当然有床旁检测的优势。1万说贵也不贵，说便宜也不便宜。
Cobas是全自动化RNA extraction和rtPCR，产量太低，占地太大。不好搞。 |
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F********h
发帖数: 346 | 20 再问一下，七万左右的budget建一个最普通的molecular biology lab能够么？大的仪
器像高速离心机，microscope，rtPCR machine不用买。 |
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F********h
发帖数: 346 | 21 再问一下，七万左右的budget建一个最普通的molecular biology lab能够么？大的仪
器像高速离心机，microscope，rtPCR machine不用买。 |
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A*****5
发帖数: 77 | 22 来自主题: Immigration版 - 求审稿机会 求审稿机会
我是神经生物学方面的，求在Cell death, neuro-degeneration, aging, or RTPCR
review的机会，请推荐！ |
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L******8
发帖数: 828 | 23 来自主题: Immigration版 - 求审稿机会 RTPCR is a technique... |
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h********n
发帖数: 4079 | 24 这个看领域. 我一直都发translational的期刊, 不太发很基础的; 估计对很多人不适
用.
我们刚刚接受的一片文章, 其中一个reviewer提的问题, 我们其实是用临床数据(RTPCR
, IHC and ISH on clinical sample)来回答.
,
figure) |
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a****o
发帖数: 1786 | 25 Do you mean technical replicates or biological replicates?
Technical replicates should be very similar. It is more likely that your
biological samples are not very similar. rtPCR itself should be very robust
unless you are dancing on the edge of its detection limit (>30 or >35 cycles
). |
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w******a
发帖数: 1527 | 26 We borrowed the stem cells from other labs.
I was trying to induce them to differentiate into osteoblasts, adipocytes,
cardiomyocytes.
I did the q-RTPCR to test the expression of markers, however, I found that
untreated MSCs express higher markers than those treated...
What should I do next? |
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m**********2
发帖数: 57 | 27 想分析比较两个样本之间的某个信号通路中的所有基因和一些target基因的表达状况。
有谁知道哪家公司提供这种specific signaling pathway的 RNA array? 最好是基于
hybridization的而不是RT-PCR,因为没有RTPCR仪，要去借比较麻烦。谢谢提供帮助。 |
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p*******r
发帖数: 59 | 30 Career Opportunities at JCVI Infectious Disease (8 Positions)
The PIs did not ask me to post here, I did this just in case someone is
looking for similar positions but did not see these, and I would be happy to
see some chinese fellows to come. All the PIs are very nice.
All listed at
https://careers.jcvi.org/careers/Careers.aspx
http://www.jcvi.org/
No. 1 & No. 2 Post-Doctoral Fellows
Job Responsibilities
JCVI is looking for two Post-Doctoral Fellows to join the Infectious Disease
Group in our ... 阅读全帖 |
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m***o
发帖数: 272 | 31 谢谢楼上各位。
tozifeng85: 蛋白纯化不出来是不可以打质谱吧，有3个离的很近的ATG都在读码框架里。
juzbox，我做的这个gene有全gene序列，而且已经知道全长cDNA的序列，就是根据全长
序列，我才能说这个短的有3个ATG都在读码框架里。知道基因组序列信息可以怎么做而
不用做RACE呢？有什么网站或者软件推荐吗？
另外蛋白N端比较保守，我觉得不对呢，我读了些alternative splicing 的文章，大部
分是N端不一样，而都保留相同的C端。
我现在比较确定拿到了比较靠5‘端的序列，但是不能保证就是最长的，而且再上游没
有ATG。 现在打算是先设计几个引物，在得到的最长的序列的5’和3‘端，做RTPCR，
然后看看产物强弱，再设计几个RACEprimer比较靠近5’端，再挑一轮clone测序。
另外先转录下游exon再转录上游exon的情况没有人遇到过吗？ |
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m***o
发帖数: 272 | 32 Thanks, whitesand.
1. We are thinking of doing that way. But most plasmid has a strong promoter
, I am guessing whenever they meet ATG they all will transcribe. The other
possible is we clone this gene's own promoter and mutate each of the 3 ATG
to see. There will be a lot of work and now I do not have any idea how long
the promoter will be.
2. If my GSP recoginze a sequence in the reverse orientation, why it
transcript the complete exon not part of it?
I am thinking of what wenqian said because... 阅读全帖 |
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y******8
发帖数: 1764 | 33 Then, dominant negative form is less likely.
Northern or RTPCR-sequencing should work. |
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m******5
发帖数: 1383 | 34 我觉得agilent的芯片质量很不错
我最近用了一批，事后RTPCR可重复率非常高，基本上高于2-fold变化的都可以用RT验
证 |
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J*****n
发帖数: 259 | 35 刚才为亲戚的孩子问行情, 得到一些牛人的私聊帮助, 非常感谢, 希望大神们继续回我
的贴给信息.
为感谢大家, 特写了点思路供参考
版上对生物有很多苦大仇深的人, 一直在苦苦追求未来的出路与契机, 做为过来人, 回
首学生物的岁月, 无异于一场恶梦, 现在改行已经多年, 给后来人点经验. 算是攒RP.
转行不一定需要倾家荡产, 打黑工赚学费, 或者让父母砸锅卖铁, 在美国读一个MBA或J
D学位. 很多事情是靠人做出来的, 不是学出来的, 社会是最好的大学. 我的思路是为那
些不喜欢学生物, 不想搞研究, 也没钱读JD, MBA的人提供些参考, 不喜勿入.
如果你回国, 拿着国内生物本科或者美国的研究生的学位求职, 处处碰壁是显而易见的
. 对口的职位少之又少, 比本科学中文, 纯英语的人工作还要难找一百倍. 学中文的可
以考公务员, 去大公司市场部做策划, 学英语的人可以到各种机构, 比如是投行, 律所
做翻译.
学生物对口的公司无非就是R&D的外企, 做生物仪器的销售与技术支持. 那些公司数都数
得出来. 要去做R&D, 还是得博士毕业, 可能还要千老N年, 研究方向要对口, 大公... 阅读全帖 |
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h******s
发帖数: 3420 | 36 Chip, rtpcr 都不难啊，tech 的工作没什么技术含量的，高中生train train 就行
从来没听说试用期这回事，没人做不了的 |
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S**********l
发帖数: 3835 | 37 你是说2000万reads？而且你这是什么逻辑啊。。。大多数reads都map到common gene上
了。那些少的还是很少。
俺上个月刚处理了所有的human和mouse的public RNAseq data，这个肯定是个问题。
quality也是问题，很多data都只能map 6,70%. 还有更低的，根本不能map的。也不知
道当初paper怎么发出来的。
我们自己做的seq，有一些只有一个read的gene，后来RTPCR发现是个significant
change candidate，按照一般处理的protocal都要去掉这些gene的（因为read太少）。
这个本来就是seq的缺陷。没办法啊。 |
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w******n
发帖数: 767 | 38 没啥讲究吧，只不过用不着random了。我有时检测多个gene，用oligo(dt),做完反转录
，取RT产物可以检多个gene，没有问题。
primer |
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m***o
发帖数: 272 | 39 谢谢ｗａｋｅｓｍａｎ回复。
就是说你用的还是２step RT-PCR了？我现在还是需要做ｏｎｅ ｓｔｅｐ，就想试着
往ｋｉｔ里add random primer是不是可以有特异条带生成。 |
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n********k
发帖数: 2818 | 40 why u "have to" do one step RT-PCR? I am pretty curious...BTW, how long is your amplicon? for QPCR, best be below 150bp, something around 50-100bp would be good...virtually every pair works if one uses a reasonable software and pick the top choices...I use IDT's website to design it... |
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h*******o
发帖数: 4884 | 41 没有完全看懂楼主的意思 , 个人理解
所有的One step RT-PCR kit都不可能用gene specific primer来做RT这一步
都是用的oligodT之类的primer来做RT,然后在接着标准的PCR而已
只不过对Taq的要求高一点而已,需要HotStart Taq
user自己加入自己的specific primer for gene of interest.
整个mixture其实就是先RT在PCR, 一般Protocol都要求42度1小时RT,然后直接65赌灭活,再开始PCR的cycle.
我以前用过很多One-step RT PCR,如果不出条带一般是自己的引物的问题
至于One-step realtime PCR 没试过
primer |
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w******n
发帖数: 767 | 42 用的就是one step kit，我的kit是先45分钟，然后正常pcr cycle, 这45分钟就是在RT
,所以我用oligo dt到这一步就停下，后面用这个做模板pcr.加random应该没问题，我
一次加过两种引物。试一下就行，也不费劲，不过你的没有条带，不一定是这个原因。 |
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w******n
发帖数: 767 | 43 从哪儿看出来LZ用了degenerated primer, random?
Synthesis/index.html
primers can be used for RT reaction:
with each having its pros and cons. |
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l**********1
发帖数: 5204 | 44 if your target mRNA its 3' UTR super long (over several kp) tor before the stop codon high GC rich region
then you can only get with normal qRTPCR then PCR whole 3RACE PCR products.
This case please try another method:
: ligation-anchored PCR cloning
一句话就是用内切酶对应的人工引物锚定: 3'端 做人工锚定引物PCR
mRNA with a primer (3'-poly
(dT)17 with an anchor sequence at its 5'end, then qRTPCR then PCR sub cloning... sequencing.
References:
//genome.cshlp.org/content/4/1/19.full.pdf
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles... 阅读全帖 |
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w******n
发帖数: 767 | 45 one step rt-pcr用的就是 gene specific primer RT,说明书里通常说不推荐用random
或oligo(dt).
活,再开始PCR的cycle. |
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h*******o
发帖数: 4884 | 46 了解了
原来我一直以为one step RT-PCR的master mix里面有oligo dT之类,用来做RT step
然后user 自己加入的gene specific primer只是用来扩增用的
hoho, 傻兮兮的用了好几年都不知道原理
谢谢!
random |
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l**********1
发帖数: 5204 | 47 Your original thought is regular 3' RACE
oligo dT its target is poly (A) tail
but for super long 3' UTR (over 3 kp) mRNA that regular 3' RACE does not work
from even you do not know the extension time for that PCR before your did
Northern Blotting or similar experiment for knowing the full length of 3' UTR region. |
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w******n
发帖数: 767 | 48 其实我也不知道你在说啥，他的primers是work的，下游primer应该不会设计在3'UTR。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 49 楼主 没有确定的可以general qRTPCR的两组碱基序列才会问这个贴的吧
有时候就得用特殊的anchor adaptor ligation qRTPCR and relative PCRs
details steps 请看图
snap copied and pasted from
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14660366
NB: for which kind of restriction enzyme that fit to your target,
case by case just by your PCR cycling and Gel Image and sequencing cycles again and again
and your fate probability. |
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l**********1
发帖数: 5204 | 50 oligo dT 没错 如target gene 只有一段很短的碱基序列(<120bp) 已知
而没有任何其上游5' 或下游3'的序列信息
只能用oligo dT qRTPCR 从poly A tail 揪出那条mRNA to single strand cDNA
then to double strand cDNA the 附加带酶切位点的各种adapter
再用那些人工加入的带确定碱基序列的 adapter 5' to 3' 对应的 反链 3' to 5' 的引物
PCR cycling
具体步骤请看图:
snap copied and pasted from
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC50225/ |
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