n**t
发帖数: 45 | 1 【 以下文字转载自 Biology 讨论区,原文如下 】
发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标 题: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记（八）
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Fri Apr 29 11:14:36 2005) WWW-POST
本文献给YL
（八）”液体DEAE“
绕了这么大一圈，现在再回到第一个模块的实验来。前面提到Dr.Burgess要我们
试Gudn HCl溶解sigma32之后的重折叠，结果很糟糕。我们接着试了用sarkosyl做
变性剂的蛋白重折叠。步骤和前一个类似，只是这一次是突然稀释至25倍体积。效果
好了很多，至少没有浑浊现象了。接着我们用Poros HS 50，一种阳离子交换柱，
来把可溶的sigma 分离了出来。为什么这一次用Poros HS 50 而不是前面用的阴离
子交换柱呢？因为sarkosyl带负电，会与阴离子交换柱结合得很好。再加上sigma32
很奇怪，既有负电的表面，又有带正电的表面，所以可以用阳离子交换柱。值得一提
的是绝大部分蛋白质都是偏酸性，所以阴离子交换柱用 |
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r****o
发帖数: 105 | 2 本文献给YL
（三） 不溶的sigma32
四月六号早上，我们开始了第一模块的实验，Burgess教授负责。这老兄研究了一辈子E.Coli的RNA polymerase。E.Coli RNA polymerase 核心酶是一个蛋白质复合体，只有合成RNA的活性，却没有
识别DNA的能力。Sigma系列因子能够识别启动子, 并且与核心酶结合，从而实现转录。我们这个实验
的核心主角就是其中一个因子，叫sigma32。Sigma32可以识别heat shock genes的启动子。Sigma 32
过表达在大肠杆菌里面的时候，绝大部分形成了不溶的包涵体(inclusion body),我们的任务就是要用变性
剂溶解变性不溶的蛋白，然后做重折叠。
所有的buffer几乎都已经配好了，所以直接做就行了。我们先用1% Triton 来溶解细菌本身的一些蛋白，
inclusion body 相当稳定，不溶于triton,所以这一步，绝大部分垃圾就被去掉了。
下一步就是用变性剂来溶解inclusion body。用什么好呢？Burgess教授提到了sarkosyl。sarkosyl(N-十 |
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r****o
发帖数: 105 | 3 本文献给YL
（八）”液体DEAE“
绕了这么大一圈，现在再回到第一个模块的实验来。前面提到Dr.Burgess要我们
试Gudn HCl溶解sigma32之后的重折叠，结果很糟糕。我们接着试了用sarkosyl做
变性剂的蛋白重折叠。步骤和前一个类似，只是这一次是突然稀释至25倍体积。效果
好了很多，至少没有浑浊现象了。接着我们用Poros HS 50，一种阳离子交换柱，
来把可溶的sigma 分离了出来。为什么这一次用Poros HS 50 而不是前面用的阴离
子交换柱呢？因为sarkosyl带负电，会与阴离子交换柱结合得很好。再加上sigma32
很奇怪，既有负电的表面，又有带正电的表面，所以可以用阳离子交换柱。值得一提
的是绝大部分蛋白质都是偏酸性，所以阴离子交换柱用的比阳离子交换柱频繁得多。
好了，聊完离子交换柱，现在回到Dr Burgess要我们作的另一个很重要的实验。
Sigma32在大肠杆菌过表达的时候，绝大部分都是inclusion body,但是也有一部分
是可溶的。这些可溶的sigma 32可以和细菌体内的Core RNA polymerase结合形
成复 |
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j****t
发帖数: 1663 | 4 我的sonication 步骤如下，具体输出功率不详（可以参考Branson的说明书）。0.8%
SDS 应该足够强了.我用的是0.1% of Na-deoxycholate and 0.2% of sarkosyl （以前
用过0.5% of sarkosyl）。我有时候看lysate是否clear了，来决定sonication的次数。
Sonicate sample (in a 15 ml falcon tube) using Branson 450 sonicator (Power
Set 2 or 4, duty cycle 100%, 4-6 times, 30 sec each with 1 min interval).
During the sonication, keep falcon tube in a 50 ml beaker filled with ice. |
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s*******e
发帖数: 23 | 5 for proteins like to stick in inclusion bodies, I strongly recomment
my protocol (in fact, from a literature I can't find the place leh)
http://www.sit.wisc.edu/~sguang/protocols/index.html
The last one is "using Sarkosyl to purify GST fused proteins"
u can try it. |
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a***e
发帖数: 1010 | 7 yeah, you need refolding most of time.
An alternative method is adding some sarkosyl during purification, which
solublizes your protein into the supernatant. |
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b******n
发帖数: 4225 | 8 嗯，你可以用只融内膜的detergent
比如Sarkosyl或者Deriphat 160
membrane |
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c********b
发帖数: 363 | 9 每个步骤都是别人都知道的,我只是组装了一下. 最大不同是别人是先Urea变性,提出来
再复性.我是利用Triton X-100可以洗脱SDS的特点利用SDS变性,然后Triton X100洗脱
复性,然后过柱. 肯定不会对所有蛋白适用,但是起码我遇到的都work (包括一个>100
Kd的酶).
我是用的sonication water bath, 也可以用probe sonication再加SDS,都OK,但是注意
dilution的比例和体积.
Good luck. 用的高兴分我几个包子.
Key, keep a fraction from every step for analyses and trouble shooting
- Culture the E. coli overnight
- Induce it at a proper concentration of IPTG, room temperature for ~
4hrs
- Pellet the E. coli at 6000 rpm at 4 degree
- R... 阅读全帖 |
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j****t
发帖数: 1663 | 10 我是在这个lysis buffer里作sonication的。我现在用0.2% sarkosyl（instead of 0.
5%）,和 1% of Na-deoxycholate。sonication的效果很好。而且这个浓度的detegent
对于IP 来说还是高了些，我会在做IP前把sample稀释一倍。
我觉得你的lysis和sonication 的条件也许可以了，问题说不定是在reverse-
crosslink。我的快速检测片段大小和ChIP DNA浓度的步骤如下，供你参考参考。
Check chromatin size and conc.
1. Dilute 50 ul chromatin extracts with 50 ul TE buffer. Add 4 ul of 5 M
NaCl and 1 ul of 10 mg/ml Proteinase K (Invitrogen #25530-015) (use a PCR
tube).
2. Incubate at 65 oC for at lease 4 hr (using a PCR machine) ... 阅读全帖 |
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