s********n
发帖数: 2939 | 1 Then I moved to culture more and lysed the cells using a sonicator, after
resuspending the pellet with 1x cold PBS/1% PI. After all these, I loaded
the supernatant and pellet side by side and stained by GelCode and a bulk of
protein (I assume it was protein) was detected in the pellet part.
你有没有在supernatant中检测到你的target protein？如何检测的？WB or activity?
从你的表述你好像没有做WB。
Then I tried 1L culture and repeated the 2nd experiment. This time, I
incubated the supernatant with glutathione sepharose 4b beads an... 阅读全帖 |
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v******n
发帖数: 257 | 2 最近一直挣扎在这个chromatin IP上
用的是293细胞，死也做不出来。试过了两种beads，protein A support和santa cruz的
protein A/G agarose，背景超强。跟老板分析了半天应该是beads的问题。
请教一下做过类似实验的同学们，哪家的beads比较适合做ChIP啊？
在网上找到了两个，upstate的protein A agarose/salmon sperm DNA和GE的protein A
sepharose。哪个好一些呢？ |
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n***w
发帖数: 2405 | 3 最近用GST beads，有个疑问，
bacteria pellet我没有用PBS dissolve，而是用了自己配的一个solution, 内含1.5%
N-lauroylsarcosine，25mM TEA和
1mM EDTA (pH 8.0)。
最近发现binding有些问题，因为ideally, binding前后的supernatant应该最明显的区
别就是target protein少了，这个我
没有观察到。
我在想到底是哪个地方出了问题。
有经验的同学指点一下～谢谢！ |
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T****O
发帖数: 407 | 4 Is your pH accurate? Is your pH meter calibrated properly? |
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n***w
发帖数: 2405 | 5 我这个solution没有测pH，这个也是我在想的一个问题，我要不要用PBS来配这个
buffer，然后将pH调到7.3。
我试一下明天。
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h*****b
发帖数: 492 | 6 为啥用lauroylsarcosine ? 这东西好像对珠子不好吧。ionic detergent,而且对你的
蛋白也不好啊。
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n***w
发帖数: 2405 | 7 Because most of my protein is in inclusion bodies and I don't wanna directly
go to the last resort dissolving
with guanidine hydrochloride, I found a protocol using this detergent to
increase the production of soluble
protein.
I know nothing about its physical chemical properties and I haven't thought
about the impact of this
ingredient.
Thanks. |
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m******5
发帖数: 1383 | 8 最明显的应该是beads上蛋白拿到一大堆
蛋白产量高的话轻易就能饱和beads,很难看出来的 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 9 虽然我们也用pH 8的条件做GST蛋白纯化
但是好像pH 7.4是最佳binding
tech support的人也这么说
说buffer什么的不重要
重要的是pH
你的bead会不会饱和了？
然后我还遇到过的是除了融合蛋白以外还有27 kDa的GST-tag only表达
表达的还挺多
然后跟我的融合蛋白竞争
很容易就把柱子饱和了
哦，还有一个
你提到你的蛋白是inclusion body
我没用过N-lauroylsarcosine
如果好用的话回头汇报一下哈
不过我遇到inclusion body的时候用过Pierce的B-PerII
很好使
结果大部分都变成可溶了
当然我的那个例子比较极端
光用sonication是大多数都在pellet里
用B-PerII加sonication以后大多都在上清里
我一升的e.coli居然提了快100 ug的蛋白
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b******n
发帖数: 4225 | 10 100 ug/L的产量好像少了点，是不是蛋白有毒性或者太大？ |
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n***w
发帖数: 2405 | 11 嗯，有可能饱和了。
我昨天把1st binding后的supernatant又加beads了，看好没好些今天。
我觉得N-lau还是挺好使的。能solubilize大部分pellet。
我500ml的culture提了差不多160ug的蛋白。。。
我下次买点你说的B-Per试试好了～ （不过看成分也差不多）
我现在的protocol基本上是：(For 500ml culture)
1. thaw pellet on ice
2. add 18ml GST buffer (配方见上)，add 1% PI, add 2ml lysozyme (10mg/ml)，
mix on ice for 30 seconds
3. pass thru 20G syringe to reduce viscosity, also add DNAse 40ul (1mg/ml).
4. sonication (it will become clear)
5. 10000rpm, 40min，4deg
6. collect supernatant for GST beads binding
不过我这次还是将G... 阅读全帖 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 12 昨天晚上稀里糊涂吧单位打错了
是一升提了100 mg |
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C*******e
发帖数: 4348 | 13 记下了
谢谢！
下次要试试看。
(1mg/ml). |
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n***w
发帖数: 2405 | 14 哇。。。
还有就是我这次的GST buffer是用PBS配的，不是用水，也许有些salt的成分比较好把～
谢谢包子～ |
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v***a
发帖数: 1242 | 15 请教一下 B-PER和Y-PER区别大吗？
我用BL21(DE3)，可以用Y-PER提吗？ |
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h*******n
发帖数: 2052 | 16 how about sepharose beads? |
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t********n
发帖数: 64 | 17 最近做Co-IP，beads用的是GE的Protein G Sepharose 4 Fast Flow，结果发现用的和
我目的抗体同源的IgG也能拉下目的蛋白来，我怀疑是beads的作用，大家有遇到过这种
情况吗？ |
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g*****y
发帖数: 6325 | 18 这个方法只适用于有tag 的蛋白吗？ 如果是用s/q-sepharose来纯化蛋白可以吗？
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c********b
发帖数: 363 | 19 我没有试过,不知道.你可以自己试一试.
理论上Triton X-100可以把蛋白上associate的SDS洗脱下来形成micelles,然后蛋白可
以得以复性.至于这样对sepharose柱子有什么影响我就不知道了.但是可以试试.
good luck |
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b******y
发帖数: 627 | 20 If you still see some full length product, put a His tag at the C-terminus.
Using Ni first and then glutathione sepharose next. You will produce some
good stuff. Due to dimeric nature of GST, it is still not ideal.
If you can, make a MBP-YPI-His. Using Ni first and Amylose second, you will
get pure protein. And the yield can be enhanced as well.
Good luck! |
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L*****t
发帖数: 56 | 22 制备级别其实都差不多，国产的NiNTA用一两次效果不错但是再生后效率下降。Qiagen
的IDA树脂还有Clonetech的那个专有填料都还可以。不差钱就直接买GE的HisTrap(
NiNMPNBTA)或者Chelating Sepharose (IDA）。 |
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j*****a
发帖数: 92 | 23 阴离子交换色谱 Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare Life Sciences)pH
stability Working Range 2-12 .用1 M NaOH 洗,用纯水洗到pH 7, 换TrisHCl
buffer pH 5.5 平衡, elute pH 变成9.洗了一天还是pH 9. 有人遇到过吗？ |
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f*****s
发帖数: 104 | 24 以前一直用GE (amersham)的Heparin Sepharose CL-6B提纯几种transcription factor
. 现在发现市面上已经没这种产品了。有没有人知道是否有什么替代品？ |
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e****s
发帖数: 1125 | 25 那用Heparin sepharose fast flow就行了。
factor |
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a********g
发帖数: 558 | 26 最近做GST-tag的蛋白纯化，蛋白纯化出来后，在sepharose-４bbeads上切，elusion下
来蛋白总有杂带，一条大概７０kd，一条２７kd后者经检验发现是GST。前者未知，请
大牛们帮忙判断下是什么原因？ |
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l**********1
发帖数: 5204 | 27 CA630 1%
Immunoprecipitation of IMC components. Highly synchronized late-stage
parasites were purified over 70% (wt/vol) Percoll, and proteins were
extracted by
incubating them on ice for 15 min in RIPA buffer (1%
octylphenoxypolyethoxyethanol
[IGEPAL CA-630], 150 mM NaCl, 0.5% sodium deoxycholate
[DOC], 0.1% sodium dodecyl sulfate [SDS], 50 mM Tris, pH 7.4). Soluble and
insoluble fractions were separated by centrifugation at 12,000 g for 10
min at
4°C. Soluble lysates were incubated for 1 h... 阅读全帖 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 28 Isolation of nuclei for the co-IP and whole ChIP protocols is based on the
methods of Gendrel et al. (2002, 2005), Johnson et al. (2002), and Nelson et
al. (2006).
METHOD
For extraction and co-IP of nuclear proteins, see Steps 1-39 (Fig. 1). For
the ChIP procedure, see Steps 40-69 (Fig. 2).
Figure 1.
View larger version:
In this page
In a new window
Figure 1.
Flowchart for the timeline and organization for co-IP of nuclear proteins
from Arabidopsis seedlings.
Figure 2.
View larger versio... 阅读全帖 |
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f*****f
发帖数: 195 | 29 为啥不用glutathione sepharose，肯定比一般抗体效率高得得多。 |
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f**********r
发帖数: 95 | 30 可以试试先把抗体偶联到protein A sapherose beads上。这样可以把beads表面的
抗体浓度做得大，而且antibody和beads解离的问题就不存在了。我经常这么做，感觉
效果好很多。 |
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l****y
发帖数: 398 | 31 可以screen一下不同buffer
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.2 |
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Z******5
发帖数: 435 | 32 听说有人做这类实验会用福尔马林先处理一下细胞，一些结合比较弱的蛋白就很容易被
拉下来了。
在这里请教一下各位，这种方法可不可以使用？ |
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s******s
发帖数: 795 | 34 谢谢楼上的回答，10个包子奉上。话说，你的ID。。。。。。
1.结合力够强就好。那我的设计思路基本可行了！
2.washing和elution肯定要摸条件。这个我有心理准备。
3.谢谢，我去多挖挖文献。
4.你的point我get了：）。。。这个没法保证。protein A是个肽段，老板要我不考虑
生物学活性了，只管相互作用（我倒，这还是做science么，不过老板就这样说滴。不
过其实把这个肽段跟biotin共价结合或者直接偶联到sepharose上，或者任何其他偶联
操作，说不定就已经改变了其功能了，所以。。。就不考虑那么多了）
Any input is welcome！有搞过类似的，直接给产品+protocol信息吧，包子求！ |
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s*********n
发帖数: 128 | 35 http://link.springer.com/article/10.1007/s13361-014-1059-9
Herein, we developed two novel cysteine-based quantitative proteomics
workflows. The first method is cysteine-selective precursor dimethyl
labeling (cysDML). In this workflow, cysteinyl-peptides are captured on a
commercially available Thiopropyl Sepharose 6B resin and captured peptides
are labeled on resin with either light (–C2H6) or heavy (–13C2 2H6)
dimethyl tags [43]. CysDML appears to be a convenient, efficient, accurate,
and affor... 阅读全帖 |
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f*******K
发帖数: 34 | 36 我知道这篇文章，Sample Multiplexing with Cysteine-Selective Approaches:
cysDML and cPILOT, 相关工作在ASMS会议报道过。他们所用的方法基本还是基于传统
方法改良如Thiopropyl Sepharose 6B resin和Cys TMT，这些基于抗体和resin方法的
富集效率比较低，从鉴定数目就可以看到。我们的富集效率可以达到97%，很轻松鉴定
到10000+ unique peptides。
目前没有同时含有iodoacetamide+phosphate的tag。phosphate可能会被phosphatase酶
切掉，phosphonate不能，因此更加稳定。
至于为什么要富集Cys peptide,因为其low abundance,essential for the biological
activity and structure, highly sensitive and reactive.
同时富集目的是研究PTM crosstalk.在我的文章里面有很好的例子，protein tyrosine
... 阅读全帖 |
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j*****a
发帖数: 92 | 38 阴离子交换色谱 Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare Life Sciences)pH
stability Working Range 2-12 .用1 M NaOH 洗,用纯水洗到pH 7, 换TrisHCl
buffer pH 5.5 平衡, elute pH 变成9.洗了一天还是pH 9. 有人遇到过吗？ |
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m*********k
发帖数: 10521 | 39 [Yoga] [我和瑜伽]征文活动 奖励
100*2=200
成功奖励 100 伪币的用户: sepharose, axar |
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m*********k
发帖数: 10521 | 40 [pets] yidingjizhu Aug 7. ● 夏日活动总汇 奖励
100*25=2500
成功奖励 100 伪币的用户: mooth, calvinnju, takki, emmaxuxu, Athenaever, schordingcat, Jeepfan, YMcDullY, anir, QQGINA, xiaochaiyu, leico, littlehead, ConnieW, zsquare, nemat, frada, sepharose, mmmjj, Zoei, tuboshu, guagua1012, stchenhua, whoru007, njchina
注：本活动由站方赞助。
PS：活动做得很好，辛苦了！ |
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y*********u
发帖数: 14561 | 41 此活动为站里资助，经费申请贴请见http://www.mitbbs.com/article/WBCenter/12519827_3.html
1 版面活动：手续费无；
2 代发版面： Pets
3 代发事由(主题标题或链接）：
炎炎夏日活动
主办联接： http://www.mitbbs.com/article_t2/pets/31863297.html
活动总汇： http://www.mitbbs.com/article_t/pets/31889423.html
4 伪币金额：3600 伪币， 站内资助。（参赛选手太多了）
5 奖励/代发包子数量：以下第一组id奖励伪币100，第二组奖励伪币80，请注明
pets版娃娃活动
第一组：frada, RNC, benjaminni, MayQ, kathyoasis, iceloop, catpaw, NWWolf,babelfish, heidi, tuboshu, komachi, Teddyh, nnno, smiling85, aiyaya... 阅读全帖 |
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m*********k
发帖数: 10521 | 42 [pets] yidingjizhu Sep 25 ● 娃娃活动总汇
100*16+80*25=3600
成功奖励 100 伪币的用户: frada, RNC, benjaminni, MayQ, kathyoasis, iceloop, catpaw, NWWolf, babelfish, heidi, tuboshu, komachi, Teddyh, nnno, smiling85, aiyayayaya
成功奖励 80 伪币的用户: YMcDullY, likejie, sepharose, cittan, whoru007, zsquare, pipipi, leico, michelleucla, pinkpiggie, teataste, chaperone, sturgeon, ConnieW, OPTkiller, medu, mooth, summerfxy, ucalaly, diana2009, nemat, schordingcat, honeybee, yidingjizhu, waiwaimimi |
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y*********u
发帖数: 14561 | 43 注：1）版面活动：手续费无；2）个人申请：手续费10%:
1）版面活动：手续费无
代发版面/ID:
pets 版面
代发事由(主题标题或链接):
代发瓷牙咧嘴活动奖励
赞助（有：附链接，没有：无）:
无
楼主是否计入统计:
是
奖励金额:
1000伪币，从版面扣除
备注:
请给以下ID，每位20伪币
catdoudou,xiaochaiyu,tuboshu,PuddleB,rennina,winner2012,yidingjizhu,mooth,
sunjot,violetljj, casperalex,Icelus,wakakiki,ycx1215,Busywithbaby,yunyun630,
qxy26,xiaochouyu,rayyuri,Texas1234, oregongirl, meganlv,zsquare,papayaleaf,
xibeimunan,kikislove,szhwife, Yyidy, oml, reincarnate, ycx1215, pennyyin,
codeofsmile,starcraft114,dizzyfafa,coocee,sepha... 阅读全帖 |
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m*********k
发帖数: 10521 | 44 "[pets]xiaochaiyu Jul 24 ● 派慈活动--呲牙咧嘴"
成功奖励 20 伪币的用户: catdoudou, xiaochaiyu, tuboshu, PuddleB, rennina,
winner2012, yidingjizhu, mooth, sunjot, violetljj, casperalex, Icelus,
wakakiki, ycx1215, Busywithbaby, yunyun630, qxy26, xiaochouyu, rayyuri,
Texas1234, oregongirl, meganlv, zsquare, papayaleaf, xibeimunan, kikislove,
szhwife, Yyidy, oml, reincarnate, pennyyin, codeofsmile, starcraft114,
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YoYoHa, didexist, slowstart... 阅读全帖 |
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m*********k
发帖数: 10521 | 45 "[pets]yidingjizhu Sep 1 ● 辣椒哥哥八岁了"
成功奖励 10 伪币的用户: rennina, awq, catcandy, monkeyface, xiaokanma,
solidqd, wy2012, zrset, xiaochaiyu, Keala, DandM, buzzard, viyale, YMcDullY,
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tuboshu, Busywithbaby, ipets, mermaidyu, xiaoguai1, Icelus, ponyta,
life2008, yunyun630, zsquare, ... 阅读全帖 |
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