f******g
发帖数: 1003 | 1 想设计１００个基因的sgRNA，很费时间。
记得去年zhang feng 发表了一篇science文章，用的是人的genome-wide的sgRNA
library.
请问哪位知道哪里能够拿到小鼠genome-wide的sgRNA的序列
谢谢 |
|
l******e
发帖数: 125 | 2 本人菜鸟。想自己设计2个sgRNA KO一个基因，克隆到张峰addgene的lentivirus
system,请教要注意些什么,如何设计？有什么学习网站或资料也给个链接，多谢！！！ |
|
s*******1
发帖数: 188 | 3 计划验证几条human sgRNA，请问用293T 细胞系可以吗？
还是要用正常的细胞
谢谢 |
|
s*******1
发帖数: 188 | 4 在大规模实验前，sgRNA能否抑制target Gene应该要确认下吧。
5KB |
|
发帖数: 1 | 5 #注明译者，请随便转载：）
CRISPR英雄谱
埃里克・兰德（Eric Lander）
小鹿／译
三年之前，科学家们宣布，CRISPR技术能够对真核活细胞进行精准与有效的基因组编辑
。自此，这项技术手段已然震撼了科学界，数以千计的实验室正在将其运用于从生物医
药到农业的各个领域。然而，从一种奇特的细菌重复序列现象的发现开始，到确认这种
现象为适应性免疫系统，进而对它的生物功能特性的了解，直至开发为一项基因工程的
技术，这此前二十载相关的研究历程却不为人所知。本文正是着眼于填补这段科学历史
的空白，它讲述的是观念的演化历史和先锋人物的传奇故事，并且从中获得关于支撑科
学发现的优秀科研环境的启迪。
前言
很难想起曾经有哪一次科学革命像CRISPR这般如此迅速地改变生物学界。仅仅三年之前
，科学家宣布，CRISPR系统，即细菌通过纪录和精准攻击入侵病毒的DNA序列而进行自
身防御的适应性免疫系统，可以利用转化为一项简单而有效的技术在哺乳动物和其它生
物体的活体细胞内进行基因组编辑。CRISPR即此被全球数以千计的实验室运用于广泛的
领域，如创建人类遗传疾病和癌症的复杂动物模型；... 阅读全帖 |
|
l**********1
发帖数: 5204 | 6 cited,
>Both zinc finger nucleases (ZFNs) and TAL effector nucleases (TALENs)
>can be used to mutagenize genomes at specific loci, but
these systems require two different DNA binding proteins
flanking a sequence of interest, each with a C-terminal
FokI nuclease module. As a result these methods have not
been widely adopted by the plant research community.
from
>Belhaj K et al., (2013).
>Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop
plants using the CRISPR/Cas >system.
>P... 阅读全帖 |
|
f******g
发帖数: 1003 | 7 谢谢你的回复，我搜了一下，没有找到小鼠的sgRNA文库，只找到人的，
Human Lentiviral sgRNA Library - Cell Cycle (Plasmid #51046)
Human Lentiviral sgRNA Library - Nuclear (Plasmid #51047)
能耽误你几分钟的时间，贴的链接吗，谢谢 |
|
发帖数: 1 | 8 For those who can not access the link
I copied the content here:
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
NgAgo
15 posts by 9 authors
Davide Seruggia
Jun 23
Hi,
I tried a couple of transfections with the NgAgo plasmid from Addgene and
the 5'P oligo against GFP from the paper, but I did not see a dramatic
reduction in GFP+ as seen using Cas9 and a GFP sgRNA.
Anybody tried as well and came to the same (dead) end?
Davide
k*****[email protected]
Jun 24
Hi, Davide,
I tried th... 阅读全帖 |
|
w********2
发帖数: 632 | 9 关于off target effects,张峰认为三种可能：
1.sgrna不够特异性，两个sgrna一样的可能性是4 20方，相当于1/1billion，很小。
2.cas9的cut point错位，但还是在cas9涵盖的dna部分，所以有迹可循。
3.long exposure time，这个不好解释。很可能有未知的机制。 |
|
w********2
发帖数: 632 | 10 关于off target effects,张峰认为三种可能：
1.sgrna不够特异性，两个sgrna一样的可能性是4 20方，相当于1/1billion，很小。
2.cas9的cut point错位，但还是在cas9涵盖的dna部分，所以有迹可循。
3.long exposure time，这个不好解释。很可能有未知的机制。 |
|
h******y
发帖数: 351 | 11 Jaenisch lab最新发表的利用CRISPR同时敲除5个基因的文章。CRISPR前途无限啊。再搞
出几个inducible的CRISPR就更厉害了。
One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/C
as-Mediated Genome Engineering
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23643243
Cell. 2013 May 1. pii: S0092-8674(13)00467-4. doi: 10.1016/j.cell.2013.04.02
5.
One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/C
as-Mediated Genome Engineering.
Wang H, Yang H, Shivalila CS, Dawlaty MM, Cheng AW, Zhang F, Jaenisch R.
Source
W... 阅读全帖 |
|
y***y
发帖数: 709 | 12 也准备上CRISPR的人搭车问一下
怎么从设计的三个sgRNA里面筛选到效率高呢？
把gblock合成好之后，分别和cas9质粒共转染然后做RFLP吗？
还是收蛋白看目的基因的表达情况？
我要做的是成纤维细胞，转染效率很低，不知道在低转染效率的情况下如何筛选到效率
高的sgRNA，希望得到有经验人的指点。 |
|
f******g
发帖数: 1003 | 13 请问哪里能够买到CRISPR/Cas9小鼠文库（sgRNA).
或者有现成的软件设计sgRNA
谢谢 |
|
a****d
发帖数: 1919 | 14 准备建一个hESC reporter line, 有几个问题向有经验的大牛们请教。
我准备在目的gene末端插入XFP，那么在HDR之间是否应该这个顺序： last exon(stop
codon removed)-T2A-XFP-UTR？
目前在last exon上面找到了一些sgRNA序列，在stop codon上游大概50-150bp. 请问在
这个距离上double nicking是否可行？
另外选择好了sgRNA后，选择HDR是不是按照double nicking位置向上游选700-1000bp，
然后从last exon(stop codon removed)-T2A-XFP-UTR开始向下游选700-1000bp？没有
其他的特殊要求？
准备donor plasmid时，考虑到很难找到特异的酶切位点去匹配几个不同的片段，这种
几个大片段连接，是不是选择Gibson Assembly Cloning更容易一些？ |
|
k****l
发帖数: 279 | 15 做construct，要切的地方没有合适的内切酶
想用NEB的 Cas9 做体外的 CRISPR来切质粒，需要sgRNA，网页上建议做 in vitro
transcription
不知化学合成 sgRNA oligo 是否可行，会有folding 方面的问题吗？
谢谢大家！ |
|
n***y
发帖数: 114 | 16 High transducing efficiency, 楼上Jessecai正解，作genome wide screening 的时
候，MOI要小，希望每个细胞一个sgRNA。就是你不希望有的sgRNA因为转染效率而错过吧
没人看Feng Zhang的workshop吗
也请教中西博后提出的第二个问题。 |
|
E**********y
发帖数: 991 | 17 https://www.addgene.org/57818/
In the comment, it was suggested that "Use BsmBI sites for sgRNA cloning.
Note that this plasmid does NOT contain the 1.9kb stuffer from the pLKO.005
vector backbone." But I couldn't find BsmBI site on the plasmid map....
Also what is the sequencing primer to confirm a successful cloning of sgRNA
into this vector?
Thanks. |
|
发帖数: 1 | 18 Me again,
Tried a different region again in my cell type that I had edited
successfully with CRISPR-Cas9 in HEK293 (note that these are not the cells I
'm trying now). The guides are essentially the same except for 2 extra bp on
either side of the sgRNA sequence. Tried a number of different combinations
for nucleofection but no deletions. The first lane is PCR from edited
HEK293 gDNA that I had from before, the rest of the lanes are various
combinations of NgAgo plasmid with two 24mer 5'P guides... 阅读全帖 |
|
发帖数: 1 | 19 9月28日Joe Miano
Most of you have already moved on from this discussion but I wanted to chime
in one last time with our negative data in the mouse. Whether we used
original plasmid or a custom NgAgo that was codon-optimized for mouse with
untranslated sequences, a Kozak Methionine, and polyA tail the results were
uniformly negative. We used a 5' phosphorylated ssDNA (both IDT bought or
in vitro phosphorylated) along with the mRNA to codon-optimized NgAgo and an
HDR template we used successfully ... 阅读全帖 |
|
z*******o
发帖数: 1794 | 20 版上高人多，我想请教几个CRISPR library的问题，
我现在要做一个新物种的CRISPR的library screening，该物种基因组序列已知，也有
圈内人士做了简易的sgRNA预测程序，很多单基因的ko或者大片断的ki都已成功，只是
addgene上没有该物种的库。现在的问题是，我如果要从头建库，要花多少钱？有公司
愿意提供类似的建库服务吗？这个库是先大规模合成sgRNA然后包装进virus里面吗？
望有相关经验的给点提示，多谢。 |
|
r***z
发帖数: 19 | 21 我一直很好奇，有没有人算过针对Human或者Mouse 的genome，off-target 最高的是哪
个sgRNA？或者针对Human/Mouse 的 coding region, off-target 最高的又是哪个
sgRNA.？ |
|
w********2
发帖数: 632 | 22 三步
1.加sgrna
2.加cas9
3.加你想加的基因片段
都用pipette，加20ul，最好定量。 |
|
w********2
发帖数: 632 | 23 和谢应该没关系。但谢要做这个不难，这个门槛不高。主要是设计和合成sgrna麻烦点
儿。cas9应该是大规模e coli表达的。如果有origene的kit，就3步简单实验室操作就
可以实现了。
。 |
|
w********2
发帖数: 632 | 24 对那货的实验来说，cas9突变有两步：1.sgrna确定的切点，cas9的切割是有突变可能
，但一般都在cas9蛋白酶涵盖的dna序列，所以这肯定不是自然突变，而是有导向的。2
.细胞自然修复，这个看起来是随机的，但也不好说。因为很可能自然界从来没对某个
基因某个位点这样突变过，那么修补是否是随机还是人为的就不好说了。我个人认为第
一步肯定是非自然的，第二步看情况而定。 |
|
d********f
发帖数: 43471 | 25 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: mahmet (里约大冒险), 信区: Biology
标 题: 知识分子独家专访：面对质疑的韩春雨
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Oct 17 21:05:25 2016, 美东)
独家专访：面对质疑的韩春雨
原创2016-10-18 陈晓雪、李晓明 知识分子
►韩春雨任教的河北科技大学门口。摄影：陈晓雪
内文提要：
独家专访：面对质疑的韩春雨
韩春雨NgAgo论文可重复性争议考验科学界
编者按：
5月初，《知识分子》以国际科学媒体的标准，第一时间报道依据国际科学同行
评议的学术刊物上发表的韩春雨论文以及当时多位科学家评论，并说明其是发展了荷兰
科学家的工作。此后，国内媒体和单位纷纷跟进，因为没有新的工作进展，《知识分子
》未继续报道。从网上开始有声音质疑韩春雨文章结果，《知识分子》一直保持追踪国
内外学术界最新的动态，但不依据私下匿名来源为主作报道，直到13位中国科学家公开
实名发言后，《知识分子》才有可以较为完整、公开的事实可以报道。
NgAgo实验的可重复性争议历经数月之... 阅读全帖 |
|
m******g
发帖数: 467 | 26 最近面临着4个deadline，果然我是那种喜欢冲击deadline的拖延症患者。
希望能够顺利完成呢（应该说非完成不可）！加油！
Science 14.01.10
推荐：
1. Single-Cell RNA-Seq Reveals Dynamic, Random Monoallelic Gene Expression
in Mammalian Cells
Single cell expression of mouse of mixed background
Abundant monoallelic expression
2. Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System
Pooled, LOF genetic screening approach
Genome-scale lentival sgRNA library
Generate knockout collections
3. Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells
稍微了解... 阅读全帖 |
|
m******g
发帖数: 467 | 27 最近面临着4个deadline，果然我是那种喜欢冲击deadline的拖延症患者。
希望能够顺利完成呢（应该说非完成不可）！加油！
Science 14.01.10
推荐：
1. Single-Cell RNA-Seq Reveals Dynamic, Random Monoallelic Gene Expression
in Mammalian Cells
Single cell expression of mouse of mixed background
Abundant monoallelic expression
2. Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System
Pooled, LOF genetic screening approach
Genome-scale lentival sgRNA library
Generate knockout collections
3. Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells
稍微了解... 阅读全帖 |
|
T****u
发帖数: 424 | 28 远还没有到。
Zhang Feng确实很牛。
但Crisp这一系列的paper，除了第一批和Church back to back的那篇science,后面
的double nick,whole genome都是可以想见的，很多人都在做，只是mit资源（人，物
较其他地方多）。
即使Crisp的第一批次的paper，credit很多程度也属于2012年的Science paper，这篇
基本上确定了大的框架，并指出了可以用于genome editing.
http://www.sciencemag.org/content/337/6096/816.full.html
A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive
Bacterial Immunity
Martin Jinek,1,2* Krzysztof Chylinski,3,4* Ines Fonfara,4 Michael Hauer,2&#
8224;
Jennifer A. Doudna,1,2,5,6‡ Emmanuelle Charpen... 阅读全帖 |
|
f******g
发帖数: 1003 | 29 同问，每个基因４条sgRNA够吗?
off－target高吗? |
|
|
|
|
d****u
发帖数: 1553 | 33 哺乳动物细胞里做genome wide crisper screen的就那么几篇吧，都在大牛杂志上呢。
至于Cas9和sgRNA是不是在一个载体上，根据我们的经验，目前最好用的是Zhang Feng
lab的version 2 all in one vector。
有几个实验室载体分开的，必然会有某一个载体的滴度特别低。过这个情况也因为细胞
的不同而异，我们用的是原代细胞，不见得有普遍性。
不过我完全不能理解为什么CRISPR要分成两个载体然后再搞一个inducible system。
从screen的角度来讲，crispr library的数据明显要比shRNA library的数据信噪比高. |
|
s*****i
发帖数: 315 | 34 请问为什么不先建立一个Cas9的stable cell line,再转sgRNA library呢？
Cas9本身比较大，包装病毒的滴度会比较低
Feng
高. |
|
s*******1
发帖数: 188 | 35 能告诉我你用的那个separate vector的质粒名称吗? the one for sgRNA and the
other one for cas9.
谢谢 |
|
V******t
发帖数: 444 | 36 没错，我就是建立一个cas9 inducible 的stable cell line
然后sgRNA library |
|
m*********D
发帖数: 1727 | 37 你是说用integrated virus把cas9和sgRNA搞进genome吗？
本来是想找个不表达我的基因的细胞系，用CMV来带动mutant表达，就是传统的stable
cell line做法。但担心这种表达的量不好控制，最后也是挑表达量合适的克隆，一样
费事费时。
谢谢！ |
|
c******d
发帖数: 647 | 38 非行家，不过最近也在做HDR template，
网上关于sgRNA的资源就不说了，但是关于HDR的简直太少
真的是有做的人可能就直接合成ssODN了，可是我想插入比如FP，两边的arm也想1-1.
5kb 长，所以现在也想自己设计plasmid,现在还没做到那步
Zhang的paper说应该linearize donor vector;但我看到别的source说如果用
linearized donor,会增加随机integration的可能，用全plasmid就可以了
cas9 |
|
c****r
发帖数: 9 | 39 张锋去年已经开始到处给talk, 说明他们早在2012年初就开始研究crispr在human cell
的应用。他有实验记录为证。而且他的第一篇crispr文章明显开始是用细菌二片段系统。
如果是follow up，他们就会以doudna的单片段作为sgRNA. |
|
j********r
发帖数: 156 | 40 which CRISPR vector(S) have you used to introduce single AA mutation? There
are tons of vectors on Addgene, such as all-in-one vs cas9 and sgRNA in
separate vectors, regular or viral vectors. Any comments or protocol will be
highly appreciated! |
|
V******t
发帖数: 444 | 41 我去年10月开始建reporter细胞系，今天才做了病毒sgRNA库第一次transduction
是不是太慢太慢了 。。。
用的feng zhang的GeCKO库，老鼠ES干细胞
急死我了 太慢了 这个速度 别人文章都发表了吧
老板会不会fire我 。。 |
|
n********e
发帖数: 50 | 42 这个addgene的质量控制非常差，从它那里买10个质粒有1-2个work就不错了，尤其是
library的质粒。先前买了这个Human GeCKO v2 Library (1 Plasmid System), 无论是
PCR，挑单克隆测序，或是按照文献去酶切，都不能准确得到sgRNA。而且，addgene的
客服很差，总是推脱不是他们的问题，而是我们这里的检验手段不对，真是笑话。前后
花了750刀，就算打水漂了。提醒大家买这家的质粒一定要小心了。 |
|
r********s
发帖数: 149 | 43 从那里买过几十个，只有一个空载体好像不对。
[在 neveralone (have fun) 的大作中提到：]
：这个addgene的质量控制非常差，从它那里买10个质粒有1-2个work就不错了，尤其是
：library的质粒。先前买了这个Human GeCKO v2 Library (1 Plasmid System), 无论
是PCR，挑单克隆测序，或是按照文献去酶切，都不能准确得到sgRNA。而且，addgene的
：........... |
|
m********2
发帖数: 317 | 44 我现在也遇到同样类似的问题，在one vectorv系统，即是sgRNA和cas9在同一个在题里
面表达，我得到的病毒的titer很低，试了各种方法，包括浓缩病毒，titer还是很低。 |
|
s*******1
发帖数: 188 | 45 addgene上买了zhang feng实验室的lentiCRISPR V2质粒，然后老板从文献上找了两个
sgRNA，克隆进去，做病毒，转染细胞，这些都是常规实验，没有任何问题。
然后老板让我测序看看是否对目的基因的编码序列产生影响。
由于是新手，看的文献也不多，请问大侠们，怎么能够测序分析出sRNA对目的基因的编
码序列的改变呢？
谢谢 |
|
z*t
发帖数: 863 | 46 他们这个project省事的一点是只用两个sgRNA,因为都是很类似的序列所以一次就搞定
了-_-.算是对off-target的灵活应用，anyway，idea很酷啦 |
|
v********e
发帖数: 1597 | 47 我有protocol怎么体外转录，纯化sgRNA用于micro injection,留个email,可以发给你
，不难做 |
|
|
m*********D
发帖数: 1727 | 49 我设计的时候没验证，主要是赶时间。
验证么，就是找一个transfection效率比较高的细胞，这个293显然合适。如果你的细
胞有很高的transfection efficiency,应该更好。理由是不同的细胞系之间会有SNP，
如果运气不好，正好在你的guide sequence之内，那在293验证的结果可能就不完全反
应你的细胞系的效率。
上面是我的理解。这里CRISPR expert多，清指正。我一般设计好guide sequence后，
会PCR一小段我准备用的细胞的genomic cDNA，测序保证没有SNP.上次测了一个2。5KB
片断，有三个SNP,但都不在我的guide sequences之内。 |
|
|
