t****g
发帖数: 120 | 1 请问直接做virus infection是什么意思？ 给细胞加上virus，三天后收RNA吗？
我还想做些functional assay，比如proliferation assay, apoptosis assay, 所以想
着如果有stable cell lines会比较方便些。 |
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F*K
发帖数: 608 | 3 最近刚开始接触ES cell，研究一个基因的功能。几个stable shRNA KD的细胞系，从形
态上看和control KD没有什么显著区别。
请问一下我该从哪里着手找phenotype呢？
谢谢 |
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c*****g
发帖数: 66 | 4 1）肯定是pri好，miRNA的preprocessing应该是context dependent，比如说有些
intronic的miRNA的mature是coupled with splicing的。当然，你可以minimally
define可以被细胞preprocess的pre-miRNA，那肯定会更简单一些，这个是不是叫shRNA？
2）关键的问题是你的RNA包含了你需要的所有序列吗？如果是，不就是一串DNA吗，什
么做模板没区别。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 5 now please try
RNA-Seq
//www.ii.uib.no/~inge/inf389-2010/nihms229948.pdf
plus shRNA not RNAi
microarray is one and half decade ago technique
and RNAi is one decade ago technique.
more please go to
2008 SUNY one PhD dissertation
full text pdf link:
//dspace.sunyconnect.suny.edu/bitstream/handle/1951/47599/000000431.sbu.pdf?sequence=3 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 8 Under stress likes Tumor
Please go to
Title:
Potent antitumor activity in experimental hepatocellular carcinoma by
adenovirus-mediated coexpression of TRAIL and shRNA against COX-2. |
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l**********1
发帖数: 5204 | 9 shRNA based high throughout fluorescence screening and identification with
NGS platform?
paper:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22219365
and
Tools:
//codex.cshl.org/research.php
outsourcing NGS service:
//www.genetics.pitt.edu/forms/flyers/GPCL-NGS%20flyer2_11.pdf |
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k****n
发帖数: 42 | 11 thanks very much!! very helpful!!! |
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Z******5
发帖数: 435 | 13 pll3.7通常是用来表达miRNA或者shRNA的。
最近想构建一个表达蛋白的载体，但是手上只有这套病毒系统。想问问：
1，有没有人用过这套系统表达蛋白？
2，mU6启动子应该是不能用吧，是不是要用CMV启动子，和GFP做融合表达？
3，我要表达的是一个转录因子，担心与GFP融合会影响其功能。考虑将 CMV+GFP 这段
用 CMV+外源基因+IRES+EGFP+SV40 polyA 替换掉，这样构建好的载体就有近10kb了，
会不会影响病毒包装效率？
另外再问一个我要过表达的是一个原癌基因，在安全性方面是不是要非常小心？ |
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r***e
发帖数: 2539 | 14 能透露一下怎么保证蛋白水平80%吗？
我们从cellecta订了一个shRNA library，近期准备制病毒了。
如你所说，knockdown效率很难保证啊。
不方便的话，请站内信。
library |
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d*p
发帖数: 534 | 15 pool 比较简单了，机器能做好的，关键的还是verify. 我们计划是自己verify这20个
shrna, 把最好的拿出来，pool，也卖单个基因的。
报结
gene
lib |
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a*****x
发帖数: 901 | 16 难道是用pentamer? 这个成本也不小。而且siRNA或者shRNA的off-target effect是主
要问题。个人认为继续发展haploid cell比较有前途。已经做出human iPS的haploid
cell了。
library |
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d*p
发帖数: 534 | 17 为什么一个基因要做两个shrna,就是为了避免off target. |
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p******b
发帖数: 379 | 18 我觉得如果这个能做出来的话市场还是很大的， 呵呵， 现在ShRNA 之类的需求太多了
，请问你蛋白水平用什么技术鉴定呢？ WESTERN BLOT吗？ 检测内源蛋白的话工作量
和成本就很大了。 可是如果是检测外源蛋白的话，能不能肯定在内源蛋白上也有相同
效果呢？
library |
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S*********s
发帖数: 304 | 19 很多时候不是shRNA序列的问题
很多organelle localized的protein的turnover时间就是比较长。
即使mRNA knockdown了，蛋白降解还需要很长的时间。
另外跟cell line也有关系。
Barcode。 |
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r***e
发帖数: 2539 | 20 我们定的是5000个基因，每个基因5个shRNA，给200-500ug质粒，自己包装病毒。
价格好像是15K左右，不是我经手的，所以不清楚。 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 21 唯一可靠的就是rescue试验...
兄弟你有可靠的lenti vector for cDNA吗？
装了一堆lenti质粒就没有一个能表达蛋白的...
shrna |
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s*****g
发帖数: 7857 | 22 是啊,从QIAGEN买的SHRNA都是给五个不同的质粒的. |
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g*********5
发帖数: 2533 | 23 用过Openbiosystemde pLKO shRNA，效果很好
想用lentivirus表达稳定珠。
买了invitrogen的pLentidestz载体，构建质粒，转染293，收上清，感染细胞，过两天
加抗生素，细胞活，但是目的蛋白不表达。
addgene又买了些pLentidest，装载体，。。。。细胞活，不表达
addgene买了pLX,装载体.......................细胞活，不表达
折腾两年了...
到底问题出在哪里？
请作lenti表达的牛牛们帮我分析分析。谢谢。 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 24 这些细胞应该能用的，mel，lentivirus shRNA没有问题。
没有试293。你的意思是感染后的293还可以wb检测？
还是用上清去感染293？谢谢。 |
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r***e
发帖数: 2539 | 25 不行。
另外包装lenti也要注意，尽量用第三代的。
切记不能把不同generation的vector和pkg mix混用，
有的公司为了规避patent，还在出售第二代的vector，比如说Openbiosystem有名的pLK
O shRNA vector，和Thermo的部分产品。
以前有实验室出过事故，包装出不安全的病毒。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 26 >
是的。基因敲除小鼠模型已经建立了。但是机制未知。我们描述可一种可能的机制。
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With shRNA/RNAi IN VIVO Mice body proof results?
i mean step by step prove that unknown your found 可能的机制? |
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r***e
发帖数: 2539 | 27 如果用一个promoter，可以用一个2A把两个基因连起来。
他那个情况是必须要两个不同的promoter。 |
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r***e
发帖数: 2539 | 28 我回答他问题的第一部分，针对Tyler的那个载体。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 30 if by GFP not luciferase
you can try CAG (cytomegalovirus (CMV) early enhancer element and chicken
beta-actin) promoter
paper link:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22378886
Mice strain link:
//jaxmice.jax.org/strain/016532.html
Description
The CAGs-rtTA3 transgene has a CAG (cytomegalovirus (CMV) early enhancer
element and chicken beta-actin) promoter driving widespread expression of
reverse tetracycline-controlled transactivator 3 (rtTA3). High rtTA3
expression is observed in most tissues examin... 阅读全帖 |
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h********n
发帖数: 4079 | 31 thank you so much. I will read it. |
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l**********1
发帖数: 5204 | 32 De rein.
today just met that pdf file on my Mac downloads folder with largest
file size.... |
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a*********n
发帖数: 2526 | 33 想用lentivirus作knockdown, 不知道有多危险，据说lentivirus可以转染皮肤上的细
胞致癌，尤其是转染一些oncogene. |
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k****o
发帖数: 589 | 34 据我所知实验室里用的绝大部分Lenti都是改造过的，把一部分用于病毒复制的基因给
去掉了，所以不用太担心。 |
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r***e
发帖数: 2539 | 35 就是抑癌基因Rb1。要western blot识别mouse Rb1，试了两个抗体好像都不大行。一个
是Abcam ab6075，一个是cellsignal 4H1（这个data sheet里没包括mouse）。
另外，这个蛋白在MEF之类的细胞里表达量如何，（不要和p53那样，正常量很小，才没
看到。）我是鉴定shRNA用的。我有几个不同的序列，已知抑制效果不同。
谢谢啦！ |
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z****u
发帖数: 1007 | 36 多谢楼上分享。看来只是技术还不成熟，暂时不available.
我以前读一些paper,说RNAi knockdown 对老鼠的问题在于transgenic mice对于
heterozygou 非常耐受，就是说knockdown 50%都不会有明显phenotype. 而RNAi 在体
外也就70% 的knockdown, 所以构建transgenic line没啥phenotype,不知道是不是这个
原因以前一直没有line 出来。
我做transgenic RNAi老鼠主要目的是研究成体的KO phenotype.当然，reversible也是很重要的原因。 唯一办法就是构建XXX
-rtTA；teto-shRNA 来在成体knock down. |
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n********k
发帖数: 2818 | 37 second this...that said, the LZ seems a newbie too and so established line
could have some advantage...
For C2c12 lines, one could just request from different labs around, I forget
whether the other line is from helen Blau's lab at stanford or not...they
have a c2 line which is even tricker...
For knock-down, I never tried in the line and I don't see the reason but I
guess u could try the same shRNAs in c2 together with some other line, see
what happens... |
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n*******9
发帖数: 234 | 39 Hello, which paper are you working? could you give me the paper name? I am
starting to work on lentilox3.7 very soon.
thanks in advance |
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h******e
发帖数: 66 | 41 我要做一个power calcuation，关于这个的，但是我totally不懂这个东西，能有人棒
棒我么？
我有个description，但是很多细节搞不懂，我就很纠结。。。 |
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z****u
发帖数: 1007 | 42 筛选本来就不需要很确定的结果啊。肯定会是很多问题的，所以后来她仍然需要拿Tbx1
KO来研究phenotype. 这个screening 虽然是invitro,但是我觉得会是个很好的方法用
来做initial screening.
相比之下，Elaine Fuchs之前另外一篇拿lentivirus in utero injection来做
multiple gene shRNA mediated knockdown 我倒是觉得会有很多问题。 老鼠本来就对
haploefficiency耐受性很高，RNAi kockdown 能有多高效率？ 每次注射后tranegenic
位点肯定还会不同，这样出来的phenotype能有多好的重复性？ |
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b**********8
发帖数: 349 | 44 谢谢关注，我们是参考公司网站公布的序列自己订的oligo回来退火克隆的， |
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q******g
发帖数: 3858 | 45 我用过。5个里面当时有两个比较好。但是，用PUROMYCIN筛选比较麻烦。 |
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b**********8
发帖数: 349 | 46 实在是非常感谢你的回复。
只要有两个就够了，免得只有一个有效的话到时候reviewer又要提offtarget的问题了。
这下不犹豫了，直接买了。 |
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m********m
发帖数: 263 | 48 我用了两套siRNA，一个reviewer还说可能有offtarget，没办法KO，只能再加shRNA。
有些人非常喜欢overexpression，总觉得这个东西有些不可靠。尤其对那些体内组成型
高表达的genes，更有些奇怪了 |
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C**S
发帖数: 522 | 49 siRNA和shRNA在off target的问题上是不一样吗？ |
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l**********1
发帖数: 5204 | 50 stable knockdown shRNA better performance from less off-target per cent age
details please refer
Klinghoffer RA at al. (2010)
Reduced seed region-based off-target activity with lentivirus-mediated RNAi.
RNA. 16: 879-84.
PubMed link:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20348445 |
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