C*****h
发帖数: 926 | 1 用lipofectamine 2000转染3T3细胞，但是transfection效率太低（不到1％），
不知道是怎么回事？
0.8 ug plasmid DNA + 2 ul lipofectamine
转染1x10^5细胞。
不知道大家是怎么检测shRNA的knockdown的效果？
我是把带有shRNA的plasmid，转染到3T3细胞，然后用western blot检测蛋白质，
看目标蛋白是不是减少了。
可是现在转染效率不到1％，就算shRNA把那1％的细胞内的目标蛋白全部knockdown，
总个western blot还剩下99％的蛋白质。
有什么办法提高3T3细胞的转染率？有人转染过这个细胞系吗？请帮忙指教一下。谢谢。 |
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a*****y
发帖数: 269 | 2 【 以下文字转载自 SanDiego 讨论区 】
发信人: alvinpy (生命就是一场歪打正着), 信区: SanDiego
标 题: Post-Doc Positions at Pfizer
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Nov 16 20:10:46 2010, 美东)
Please send in cover letter and CV to Nathan Lee: n**********[email protected]
Postdoctoral Positions in Pfizer Oncology, La Jolla CA
The post doctoral positions will be responsible for elucidating the
mechanism of action of existing Pfizer
portfolio compounds, ensuring that we have the appropriate patient selection
strategies for such
mechanisms, aligning ... 阅读全帖 |
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b**********8
发帖数: 349 | 3
重复过的，我来之后也一直用shRNA处理细胞并陆续进行下游的一些实验。后来因为要
做ChIP,需要的shRNA量太大，我们都是自己包装纯化慢病毒的，不能满足我试验的需要
，索性就买了siRNA回来，在optimize条件的时候发现的这个问题。
那我想问下，这个rescue的实验该如何做呢？我们之前都是在转导慢病毒shRNA后第四
天收细胞进行各种实验的，对B基因的抑制可以在第3天到第7天观察得到，更短或者更
长的时间我们没做过。 |
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b**********8
发帖数: 349 | 4
当初确实设计了不同序列的两对shRNA,结果一样，只不过其中一对更为profound。这样
的话是不是可以排除shRNA的脱靶效应。
我后来比较了一下，两队shRNA分别target A基因的第1和第4个exon，后来买的
smartpool siRNA,其中两条也是target这两个exon，还有两条target 更靠近3'端，其
中好像有一条还target到3’UTR（记不清了），请问这个有什么影响吗？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 5 scrambled RNAi一般是必须作的吧，而且很多时候那个是厂家配送的，一般人
会顺手就做了。
另外，看样子，他的师姐当时没有用足够多的不同的shRNA, 所以他现在用了
另外一个不同的shRNA mixture就得出了不同的结论。
但是，现在还有一个问题是，他自己用的shRNA mixture 未必就是最好的，
说不定是因为他用的那个mixture有off target, 才导致了他的结论不一样。
在这种情况下，我也赞成你们的意见，就是先做一个rescue试试看。 |
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d*p
发帖数: 534 | 6 cellecta的library是市场上质量比较好的了，他们能做到library内单个shrna的丰度
差异在10倍内，我和他们的技术负责人有过比较深的沟通，knockdown的效率和那个公
司没有关系，大家都是按照相似的algorism设计的，互相之间差别不大，平均大概是设
计7个可以有2个大于60－70％，仍然只是平均，还有一部分基因得设计10个以上才能达
到这个效率。我们现在常用的方法就是把筛选出来的阳性基因，再设计10个新的shrna,
做2nd筛选，在这个基础上，如果一个基因有3个以上shrna，off target的可能性就非
常小了，你可以参考一下，当然构建新的library是需要技术的，我现在10ul的连接体
系，可以做到10万个克隆出来，自连的概率小于0.01％。 |
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C********4
发帖数: 308 | 7 想敲除看抑制／上调哪些基因，不是应该看mRNA的变化吗？应该做RNA seq？
ChIP seq是看该蛋白的直接target基因，也就是说该蛋白在chromatin上，绑在哪些基
因上。
如果你RNAseq和ChIP seq都做，就可以知道该蛋白直接抑制或者上调某些基因了；如果
只做RNA seq，可能是secondary effect。
做ChIP seq最关键的是有好的抗体，好的knock down用来control。
如果你有ChIP级别的抗体，和没有off target的shRNA，那你自己要做的就是养细胞，
敲低，做ChIP，得到的DNA送给公司建库测序。
不知道哪里买敲除基因的细胞。敲低的话就shRNA咯。敲除的话，得看有没有人做过，
人家给不给／卖不卖吧。或者TALEN自己敲除？这些都很花时间吧。
如果有很好得抗体，光shRNA敲除，养细胞到ChIP，两周足以。自己没做过，还是别自
己建库了，得到的DNA直接给公司，让他们做，分析好。
后面就看公司多快了。华大BGI据说把图画好，文章写好，给你最后结果。
价格不知道。
一般实验室有体系的话，一般是自己做到建库那一步；自己有... 阅读全帖 |
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w*******g
发帖数: 16 | 8 用shRNA来knock down一个基因。用相同数目的细胞做western blot后，能明显的看到
shRNA降低了蛋白的表达量，同样的细胞用来做taqman realtime pcr却看不到处理组和
对照组的区别。pcr产物跑电泳检测确实pcr产物都是单一条带。挺困惑的，请各位大牛支招啊
，多谢 |
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r****r
发帖数: 379 | 9 这不奇怪，我身边很多人发现类似现象。shrna和sirna机制上很可能有很大的不同，至
少现在看来shrna翻译抑制常发生。
牛支招啊 |
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T****r
发帖数: 4006 | 10 shRNA vector有puromycin selection? 用药晒一下...
不然就用lentiviral shRNA vector, 直接做成virus 转染.... |
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a****l
发帖数: 125 | 11 我要knockdown 的蛋白对cell proliferation 很重要。害怕用lenti-shRNA 后细胞不
长了。所以想用transient 的siRNA. 但具体Lenti-shRNA 会不会造成这种后果也不清
楚。还请在坐赐教。 |
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a***e
发帖数: 1010 | 13 Both siRNA and lentiviral shRNA methods are good enough to reach your
goal.
However, lentivirus usually has a higher infection efficacy than
transfection method. Therefore, using lentiviral shRNA may be a more
efficient
way to knockdown gene expression. |
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a*****g
发帖数: 543 | 14 then you should definetely check your target mRNA.
If possible, measure the ShRNA products as well.
I suppose your target protein does not have an extream long half life?
WHere did you buy these ShRNA virus? The TRC (Sigma) sells some validated SH
RNA. If they fail, you can request a replacement. |
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w********u
发帖数: 5457 | 15 最近头都大了，要在老鼠的cell line里面过表达和knockdown一个gene，选了L929细胞
，觉得挺简单的试验，结果两个礼拜下来，杯具了。
先是knockdown，试了siRNA pool和shRNA plasmid （4 clones），均没有knockdown效
果。重新design了shRNA，准备再试。
又做了overexpression，openbiosystem买的construct，CMV promoter （pCMV－
SPORT6 plasmid），CDS测过序列，完全正确。转染了，western blot，又啥也没有高
表达。转染效率40％－50％。
目标基因是个胞质胞核穿梭蛋白，结合RNA，功能重要但研究文献不多，表达量各个细
胞不均一，但是knockout老鼠胚胎很早死亡，无KO老鼠。
请教有经验人士，可能是啥原因？是不是L929这个细胞朱就是不容易搞啊？如果是，有
啥别的老鼠细胞容易搞的？或者还是有别的可能？
谢谢拉！ |
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j********r
发帖数: 156 | 16 如果楼主感兴趣，以后可以尝试make stable tet-on shRNA in the target cells。比
如novartis的tet-on pLKO，最近Steve Elledge也做了一个inducible shRNA vector (
based on miR30). |
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b**********8
发帖数: 349 | 17 谢谢楼上各位的意见和建议，特别感谢sunnyday战友的意见，或许我和老板交流的确实
不够，每次只是简单地汇报下data，此物鲜有更深层次的交流，当然这也有我不善于表
达和交流的责任在里面，以后尽量争取做得更好些。另外，还要感谢juicemaker战友的
建议，如你所言，我们的确也已经在着手准备构建inducible shRNA expression
system，不过我们采用的是Clontech公司的pSingle-tTS-shRNA system，而且准备用这
个建立稳定克隆然后在小鼠体内进行相关实验。
扯远了，如前文所述，我现在发现siRNA 敲掉A基因后，在两个细胞株中都观察到B基因
半衰期有显著缩短，但是B基因3'UTR的luciferase报告基因实验却无差别。所以我现在
的问题是，假设A能增加B的转录产物的稳定性这一现象是真的，但是又不是通过3’UTR
这个环节的话，那么还有哪些环节可以考虑呢？分别可以用那些实验技术来验证呢？我
看了一些关于mRNA stability方面的文献，发现影响mRNA stability的因素太多了，这
样的话我的课题又陷入了一个新的寻找机制... 阅读全帖 |
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b*****l
发帖数: 9499 | 18 对了，忘了问了：shRNA k/d A 后，测没测过 A 和 B 的 mRNA 的稳定性？shRNA 要是
off-target 到了 B 上，也许可以看出来。
UTR |
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b**********8
发帖数: 349 | 19
不明白，什么是multiple shRNA?
我们以前用shRNA的时候一般这样分组：wt，shcontrol，shRNA1，shRNA2
现在用siRNA，只分三组，wt，scramble，siRNA |
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b**********8
发帖数: 349 | 20
没有，后续的机制探索一直都用siRNA处理细胞，很久不再用shRNA了。有必要再用回
shRNA处理细胞再检测mRNA的半衰期吗？谢谢 |
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j**W
发帖数: 89 | 21 相关的文献实在不多。多谢！
CSH Protoc. 2008
Design and Cloning of an shRNA into a Lentiviral Silencing Vector: Version A.
Tiscornia G, Singer O, Verma IM.
CSH Protoc. 2008
Design and Cloning of an shRNA into a Lentiviral Silencing Vector: Version B.
Tiscornia G, Singer O, Verma IM. |
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s*****y
发帖数: 32 | 22 最近实验需要在人的细胞里做抑制p53信号通路。结果用慢病毒载体过表达p53或者
p14ARF的shRNA
后，细胞增殖明显受影响。大约在六七天左右细胞开始死亡。到后面一个细胞都不剩。
但control组转
none targeting shRNA的细胞生长正常。实验是在WI38和HFL1（都是人的胚肺纤维细胞
系）做
的。这不符全逻辑啊。不是抑制p53信号通路后，细胞增殖会加快的吗？有没有谁在人
的细胞里抑制过
p53表达的？ |
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B******o
发帖数: 496 | 23 你试过几个不同的shRNA么？
有时候可能那个shRNA积累在细胞内会造成毒性。换个别的就好了 |
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s**********r
发帖数: 1120 | 24 我用SYBR做QPCR检测细胞中shRNA的表达．因为对照细胞的CT没有数值（ＮＴ），所以
只能算deltaCT,(用U6miRNA做control)．我的shRNA的CT分别是29.43,31.56, U6 CT分
别是29.84,29.74，deltaCT就分别是-0.41, 1.82，对吧？那做图的时候直接用这个数
值就行了，还是要计算2(-deltaCT)？有明白的同学给解释一下吧，非常感谢． |
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b**********8
发帖数: 349 | 25 我没有用病毒转，而是直接转的质粒，而且这个shRNA是tet-on inducible的，没加
tetra的时候shRNA是不表达的。 |
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d******r
发帖数: 124 | 26 一般来说，RNAi是降解整个mRNA，还是其中拥有同源序列的那部分mRNA？其他部分仍然
能转译表达？我用两个shRNA降解同一个基因，但是得到的表型却完全相反。有没有可
能是因为这两个shRNA降解了不同的exon，形成了不同功能的片段？ |
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b**********8
发帖数: 349 | 27 在大牛们出现之前我先抛个砖
我觉得要完全准确的回答你的问题，必须针对两个不同的shRNA做rescue实验，rescue
实验能说明至少两个问题：
1）两种完全相反的表型中，到底哪一种才是你的目的基因真正负责的表型；
2）在1）的基础上，进一步确定引起另一种无关表型的shRNA是否有脱靶效应。 |
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d******r
发帖数: 124 | 28 一般来说，RNAi是降解整个mRNA，还是其中拥有同源序列的那部分mRNA？其他部分仍然
能转译表达？我用两个shRNA降解同一个基因，但是得到的表型却完全相反。有没有可
能是因为这两个shRNA降解了不同的exon，形成了不同功能的片段？ |
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b**********8
发帖数: 349 | 29 在大牛们出现之前我先抛个砖
我觉得要完全准确的回答你的问题，必须针对两个不同的shRNA做rescue实验，rescue
实验能说明至少两个问题：
1）两种完全相反的表型中，到底哪一种才是你的目的基因真正负责的表型；
2）在1）的基础上，进一步确定引起另一种无关表型的shRNA是否有脱靶效应。 |
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n********k
发帖数: 2818 | 30 最后都歪到purity 是否有变成同性恋
It just takes some shRNA to knock downa single gene of hers...there was a
talk at SFN fro Duc cathline's group, the movie was so interesting:)), it
took a single knockout:)))...I could clone the shRNA and you be the one to
inject her, sounds doable? |
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b**********8
发帖数: 349 | 31 针对某个基因的mRNA 设计shRNA, 靶向第4个exon，western检测KD的效果。用这个基因
编码蛋白的C-terminus antibody检测，跟control shRNA相比，这个shRNAKD的效率接
近100%，但是用这个蛋白的N-terminus antibody去检测，却只有很微弱的（~10%）的
下调。
怎么解释这个现象？ |
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d*p
发帖数: 534 | 32 肯定不能用qqPCR了，除了成本， qPCR的试验结果本身就很大误差，所以我说是蛋白水
平80％， 技术没有问题。
Qiagen, Dharmacon这些地方的，就是没有验证的，买回来还要自己做qPCR的， 有的公
司说卖5个，保证至少一个大于70％，如果没有的话，再给你五个，就是这个保证而已
。
目前市场上有的library,没有那个经过验证的，基本是一个基因设计5－10个shrna, 而
且library内各个不同shrna的丰度差异很大，100倍的变化是很常见的，这样的library
来做筛选，要找几个有用的基因容易，要做系统的研究就难了，袁俊英为什么没有筛到
王晓东做的那个基因? 就是这些原因。 |
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d*p
发帖数: 534 | 33 80％没那么容易做，我们准备是每个基因设计20个shrna，把最好的两个挑出来，如果
达不到80％，就设计更多的shrna，直到找到两个符合标准的。 |
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r***e
发帖数: 2539 | 34 每个基因20个shrna，工作量很大啊，谁来verify呢？免费分给需要的人呢，然后汇报结
果？
不过如果目的在于商业化的话，可以先做常用的基因。比如5000 cancer related gene
.
如果是每个单独设计，鉴定，最后如何pool，这也是个大问题。
我们买的是customized library，就是给他们一个lenti backbone,他们插入shRNA lib
rary。你的工艺能做吗？ |
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d*p
发帖数: 534 | 35 检测off target的技术目前还没有，或者说非常不完善，等我这个产品做出来了，到是
可以比较容易就能检测到off target的基因。
目前只有排除off target 的方法，就是target 同一个基因的多个shrna 出现同一个表
型，因为这多个shran中，每个target的序列是不一样的，因此即使出现off target,
也不会off target 同一个基因上面，所以出现相同的表型的概率就非常小了，当然这
个是不能避免同源基因的，也就是序列相似的基因。目前学界公认的就是，两个shrna
，表现出相同的表型，就能接受不是由于off target 造成的。 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 37 I tried shRNA, Very good.
shRNA from openbiosystem.
forget |
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S*********s
发帖数: 304 | 38 一般至少要3 different oligos才能自己放心
siRNA的off target是非常严重的
最严谨的是shRNA KD,然后rescue with ectopic expression
shRNA也需要2-3个independent clone to exclude clonal effect |
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m*******a
发帖数: 79 | 39 用RNAi knockdown了一个gene后，如果需要做rescue，可否用Lentivirus 去
overexpress这个gene？我觉得最好用一个construct同时表达shRNA，和一个RNAi
insensitive variant，但是这个太麻烦了。
想直接从Open Biosystems 买ready-to-use lentivirus with shRNA 和lentivirus
overexpressing the target gene，不知道可行不。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 40 Off-target 中奖拉 搂住的那单locus siRNA
还是考古下上个月的 旧贴 如何
同主题阅读：现在发文章还需要2套siRNA吗？
[版面:生物学][首篇作者：CAMS] , 2012年06月19日
answer:
一般至少要3 different oligos才能自己放心
siRNA的off target是非常严重的
最严谨的是shRNA KD,然后rescue with ectopic expression
shRNA也需要2-3个independent clone to exclude clonal effect
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31683985.html
knockdown |
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S******e
发帖数: 393 | 41 买了几个基因的siRNA pool(含3个siRNA)，同样的浓度与方法去转，有的work, 有的不
work, 用的是invitrogen 的 lipofectamine RNAiMAX
不甘心，又根据发表的paper(nature子刊)上的序列，将KD没效果的基因的siRNA序列重
新从dharmacon合成Duplex, 但转染后在我手里还是不work, 但发表的paper里用的也是
siRNA,且KD效果很好阿，所以序列应该是work的。是不是我方法有问题？
有什么好地siRNA 转染方法？ lentivirus介导的shRNA转染会不会KD成功率更高些？
多谢！
shRNA construct(不用virus，就是一般的质粒)的KD效果会不会比siRNA效果好？ 有人
比较过么？ |
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z******5
发帖数: 30 | 42 弱弱的问一下 从公司order的siRNA是双链还是单链？
是否可以从公司(如IDT)直接order RNA oligos 做siRNA用？
顺便问一下使用pLKO.1做knockdown时如果选择的shRNA序列少于21bp (如19bp)， 是否
work?有没有载体可以选择较短的shRNA？
多谢。 |
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C********4
发帖数: 308 | 43 能不能做成shRNA再一起转呢
shRNA是不是更好 |
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m*******m
发帖数: 127 | 44 我6年前用了他家的shRNA系统，问题很多，折腾了半年，彻底放弃。打击太大，至今还
在回避他家的shRNA系统。
这么多年我一直用sigma 的pLKO. 一次order5个，一般至少有一到两个有效。缺陷是
non-inducible. 最近他家也推出了IPTG-inducible modified version of pLKO, 不过
要自己clone。效果不清楚。如果有人用过，请补充。
Opent Biosystem
★ Sent from iPhone App: iReader Mitbbs Lite 7.56 |
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c*******4
发帖数: 154 | 45 对于cancer领域来说，这是一个非常不错的原始数据，值得跟进。如上所说，你必须验
证这个现象。我觉得最好的办法是能搞到inducible的shRNA，看看open biosystem的网
站，他们有pTRIPZ一类的inducible的shRNA。 |
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c******g
发帖数: 49 | 46 某基因表达受IFNg正调控.在没有IFNg的情况下, shRNA能knockdown这个基因,可是在有
IFNg的情况下,shRNA不能有效knockdown. 虽然很make sense,不知道是否有文献报道过
这个现象? 知道的请告诉我,谢谢! |
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A******u
发帖数: 61 | 47 这种和shRNA screen哪个好啊？
难道不是shRNA更好咩 |
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z********o
发帖数: 137 | 48 time point很重要。我最开始做microarray是用的诱导shRNA表达knockdown后48h的细
胞做的。只找出了10个左右的gene有2-fold change，都是零散的，这样的结果是没法
做GO term的。后来看了下protein的变化，在诱导shRNA表达后第四天，蛋白几乎被
clear了。所以有拿这个时间点的样品去做RNAseq，结果还是不行。 |
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a****d
发帖数: 1919 | 49 If u don't mind to package virus, thermo scientific has a nice lenti shRNA
collection.
www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/shrna/ |
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l******3
发帖数: 25 | 50 请教各位一个问题
我之前转了特定的shRNA，然后建了一个基因knockdown的细胞系。现在我需要在这个细
胞系上转同一个基因的一个mutation，但是之前的shRNA应该会对这个mutation有影响
吧，是不是要先把这个mutation先做个突变然后再转？
有类似经验的朋友吗？请指教
多谢
有好建议的朋友注定有好运：-） |
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