F***s
发帖数: 12 | 1 其实我觉得HA还不是最大的问题。投稿前1个月的图中2个shRNA都knockdown了geneA,但
其中一个并没有导致geneB下降，而右边的细胞生长曲线2个shRNA却是相似的。在投稿
时的图就被改过来了。
前1 |
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i*********0
发帖数: 915 | 2 最近有发现一个现象。mESCs，用一个gene 的shRNA 处理以后，通过RNA-seq， 发现整
个X 染色体上的gene 都被silence了 （程度不一，但是都在shRNA treated ESCs
samples，都有2-8倍数的reduction）。 这种现象说明了什么？
有没有做X染色体transcription牛牛来说说看？ |
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s******n
发帖数: 47 | 3 请教版上的大侠，
pol III 转录终止信号一般是TTTTT，现在想用U6 promoter drive shRNA 的表达，而
shRNA的最后两个核苷酸是TT， 比如hairpin的seq是这样的-AAxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx-
loop-yyyyyyyyyyyyyyyyyyyyTT-。 现在的问题是转录产物的3‘到底有几个T？ 如果转
录终止信号是TTTTT，那么 转录产物的3‘就可能不是T，因为最后的两个T会被pol III
默认为是转录终止信号的两个TT。
请问大侠，这样的转录产物到底是什么呢？
非常感谢！！ |
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m********2
发帖数: 317 | 4 用lenti viral vector做了个shRNA screen，测序已经做完了，现在需要个软件分析，
其实应该很简单，就是看每个shRNA的读数。
老板联系了一个生物信息组，他们说至少需要６个月，
请问大家有没有什么免费的软件能够分析deep sequence结果
万分感激 |
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Z******5
发帖数: 435 | 5 我最近也在为这事折腾呢。
我们最近买了pLKO-Tet-on，表达shRNA非常好用。整个载体10k多一点。插入shRNA后载
体也不会太大。
也考虑把这个载体promoter改成表达蛋白的，但是如果插入蛋白表达基因就会很大。最
近还在纠结中。 |
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l*******i
发帖数: 153 | 6 几个问题：
（1）你用的ESC细胞系与他们的是一样的吗？
（2）培养条件是否一样（serum还是2i/LIF）?
（3）他们是否也用了shRNA，还是KO？
（4）你是否检测了你的shRNA的效率，有时达到80%，表型也不一定能拿到。off-
target看了没？是挑稳定的KD单克隆做的实验，还是pool？
（5）这个基因对self-renewal有没有影响？
（6）对分化的影响，你与他们检测的时间点和指标是否一致？
（7）我查了今年的发表在mol cell上的几篇关于mESC的文章，不确定你指的是哪篇。
能否明示？谢谢！ |
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l*******i
发帖数: 153 | 7 几个问题：
（1）你用的ESC细胞系与他们的是一样的吗？
（2）培养条件是否一样（serum还是2i/LIF）?
（3）他们是否也用了shRNA，还是KO？
（4）你是否检测了你的shRNA的效率，有时达到80%，表型也不一定能拿到。off-
target看了没？是挑稳定的KD单克隆做的实验，还是pool？
（5）这个基因对self-renewal有没有影响？
（6）对分化的影响，你与他们检测的时间点和指标是否一致？
（7）我查了今年的发表在mol cell上的几篇关于mESC的文章，不确定你指的是哪篇。
能否明示？谢谢！ |
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w*********1
发帖数: 27 | 8 之前一直用的四质粒系统包装慢病毒。包括shRNA和普通的DNA表达。但都不是tet
inducible的。最近需要换成Tet inducible的。我想包装系统就不用变了。但需要重新
购买用于包装上shRNA和DNA的tet inducible的表达载体。老板让我去addgene上去搜。
请问各位老师有何推荐的比较好用的载体？谢啦。 |
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x*****e
发帖数: 309 | 9 其实是TRC(Then RNAi Consortium)的东西放在Sigma了，http://www.broadinstitute.org/rnai/public/。 我一般google: "shRNA+gene name+TRC" 能找到别人文章验证过的shRNA， 在到前面提到网站根据TRC ID找到需要合成的引物序列，根据addgene pLKO cloning protocol很快就做好了。当然能从Sigma买到细菌更方便了． |
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x******3
发帖数: 111 | 10 俺也不知道lamada是啥意思.
量少根你的shRNA来源也有关系，一般都是因为LOW COPY
如果你用的是sigma的SHrna, 用2xLB medium 培养细菌,量应该能提上去。 |
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d******u
发帖数: 178 | 11 我平时也用希腊字母标浓度，别人都不知道啥意思。但在很小的面积上标注确实省地方。
1微克是gamma
1微升是lambda
俺也不知道lamada是啥意思.量少根你的shRNA来源也有关系，一般都是因为LOW COPY如
果你用的是sigma的SHrna, 用2xLB medium 培养细菌,量应该能........ |
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i*********0
发帖数: 915 | 12 可以看看是不是少的那个是不是promoter的核心序列，我以前的shRNA vector上的U6也
是出现了一个mutation（具体记不得在哪个位点了），但是用shRNA转染细胞KD也不错
。 |
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S**********e
发帖数: 620 | 13 很高很高，我重复了各路神仙的开拓性作品，几乎都失败了。后来有人撤稿有人不撤稿
。更可恶的是一堆神仙养的小妖精们帮他们主子占队，什么争议都打不过。哪里有那么
多真正的发现啊？不说刻意造假了, 太多太多的假阳性了。简单举个做蛋白功能的例子。
siRNA的结果很牛很好，经常shRNA重复不出来
重复出来了一条shRNA不够要两条，两条结果一样也重复出来了，但也不够要resistant
蛋白证实下是不是蛋白作用，这个时候也不能放心，换个细胞系行吗？十有八九不行，
体外细胞系结果solid，搞到老鼠身上是一回事吗？换个品系呢？再搞到人身上呢？
一条龙下来，干净的文章没几篇，审稿人再给点意见，为了伺候审稿人再搞点漂亮的数
据。只有亲自实践，才能检验真理。 |
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发帖数: 1 | 14 shRNA 和 CRISPR plasmid 有毛区别吧？都是从origene 买现成的？ |
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发帖数: 1 | 15 shRNA 和 CRISPR plasmid 有毛区别吧？都是从origene 买现成的？ |
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A********e
发帖数: 354 | 16 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: albertsmwk (.)(.), 信区: Biology
标 题: 第一批“青年千人计划”生物类@publication列表@
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Aug 18 15:04:16 2011, 美东)
花了一个小时，深深的鄙视一下自己的无聊行径！！
125 蔡亮 男 1980年11月 复旦大学 生命
科学 2007年12月毕业于[美国]北卡大学 [美国]加州大学旧金山分校 博士后
Cai L, Mostov K. Polarity is destiny. Cell. 2009 Nov 13;139(4):660-2. PubMed
PMID: 19914162; PubMed Central PMCID: PMC2900917.
Cai L, Makhov AM, Schafer DA, Bear JE. Coronin 1B antagonizes cortactin and
remodels Arp2/3-containing actin branche... 阅读全帖 |
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s*****l
发帖数: 263 | 17 梦见观音菩萨给我治病。或巧合？
本人自己是现代西医生 出国后有读了生物医学博士 由于在美国学习太累，加上申请绿
卡期间搞基因研究工作太辛苦 (both shRNA and targeting vector cloning)，竟得了
心脏病，美国最先进的现代医学把心脏病诊断非常清楚，可是就是治不好。花再多的钱
，也不能治本。疾病让人处于死亡边缘。最后只好求助大慈大悲的观世音菩萨。念大悲
咒和观音普门品。一天晚上，梦见美丽庄严得无以描述的观音菩萨来到我身前，用手在
我的胸前轻轻一点。然后就离开了。我很快就醒来，感觉病就好了。从此后，心脏病就
真好了。不需要吃药了。也能天天跑跑步。这种经历太神奇了。难道有如此的巧合？
与大家讨论。
现在继续读佛经，还有很多其他感应在此不细说。
（念大悲咒其实容易 每天只需花半个多小时，好处多多，何乐而不为）。 |
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m**1
发帖数: 2 | 18 我想用Lentivirus介导针对某一基因ShRNA感染U2OS细胞以Knockdown该基因的表达，结
果是反复几次均未成功----感染U2OS细胞后用Puromycin筛选，细胞全部死亡。这说明
可能1）Lentivirus没有包装成功2）U2OS对Lentivirus敏感3）----？
我有该种Lentiviral表达质粒直接用Fugene
6转染U2OS细胞，然后用puromycin
筛选，有大部分细胞survival,说明Lentiviral表达质粒没有问题。
我包装Lentivirus的过程是：
Co-transfect下列质粒至 293T 细胞（用Fugene
6），48小时后，将上清液过滤，直接加到U2OS细胞上，48小时后加入Puromycin进行筛
选。
Lentiviral质粒 5ug
Gap 2ug
Rev 2ug
VSVG 2ug DNA总量 11ug, Fugene reagent 33ul.
第二次加大了DNA量，但还是不成功。
Lentiviral 质粒 10ug
Gap 3ug
Rev 3ug
VsVG 3ug DNA 总量19ug,Fugene 57 |
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p*******g
发帖数: 2976 | 19 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: albertsmwk (.)(.), 信区: Biology
标 题: 第一批“青年千人计划”生物类@publication列表@
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Aug 18 15:04:16 2011, 美东)
花了一个小时，深深的鄙视一下自己的无聊行径！！
125 蔡亮 男 1980年11月 复旦大学 生命
科学 2007年12月毕业于[美国]北卡大学 [美国]加州大学旧金山分校 博士后
Cai L, Mostov K. Polarity is destiny. Cell. 2009 Nov 13;139(4):660-2. PubMed
PMID: 19914162; PubMed Central PMCID: PMC2900917.
Cai L, Makhov AM, Schafer DA, Bear JE. Coronin 1B antagonizes cortactin and
remodels Arp2/3-containing actin branche... 阅读全帖 |
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c******g
发帖数: 83 | 20 正在准备申请绿卡，想请大牛们帮忙给一些审稿机会。
弱背景简单在这里提一下
06土博毕业：遗传学 (熟悉基因克隆，表达，发育调控)
密歇根大学千老至今：
干过 microRNA调控心脏发育相关基因，
T-cell 相关的免疫疾病（GVHD and autoimmune disease）,
lentiviral vector-based,conditional gene expression system for transgenes or
shRNAs，
beta-globin disorders such as sickle cell disease and beta-thalassemia。
在此致谢大牛和过来人们！ |
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l****1
发帖数: 333 | 21 还有几篇，求帮助。
1.VEGF-C ShRNA inhibits pancreatic cancer growth and lymphangiogenesis in an
orthotopic fluorescent nude mouse model
Y Shi, M Tong, Y Wu, Z Yang, RM Hoffman, Y Zhang, Y Tian, M Qi, Y Lin, ...
Anticancer research 33 (2), 409-417
2.Intraoperative imaging of metastatic lymph nodes using a fluorophore-
conjugated antibody in a her2/neu-expressing orthotopic breast cancer mouse
model
J Wu, R Ma, H Cao, Z Wang, C Jing, Y Sun, Y Zhang, Z Yang, ...
Anticancer research 33 (2), 419-424 |
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O***n
发帖数: 13127 | 22 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: albertsmwk (.)(.), 信区: Biology
标 题: 第一批“青年千人计划”生物类@publication列表@
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Aug 18 15:04:16 2011, 美东)
花了一个小时，深深的鄙视一下自己的无聊行径！！
125 蔡亮 男 1980年11月 复旦大学 生命
科学 2007年12月毕业于[美国]北卡大学 [美国]加州大学旧金山分校 博士后
Cai L, Mostov K. Polarity is destiny. Cell. 2009 Nov 13;139(4):660-2. PubMed
PMID: 19914162; PubMed Central PMCID: PMC2900917.
Cai L, Makhov AM, Schafer DA, Bear JE. Coronin 1B antagonizes cortactin and
remodels Arp2/3-containing actin branche... 阅读全帖 |
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S*****X
发帖数: 1129 | 23 【 以下文字转载自 WaterWorld 讨论区 】
发信人: syltool (基因治疗), 信区: WaterWorld
标 题: 梦见观音菩萨给我治病。或巧合？
关键字: 观音菩萨，治病，梦见
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Nov 30 21:41:35 2010, 美东)
梦见观音菩萨给我治病。或巧合？
本人自己是现代西医生 出国后有读了生物医学博士 由于在美国学习太累，加上申请绿
卡期间搞基因研究工作太辛苦 (both shRNA and targeting vector cloning)，竟得了
心脏病，美国最先进的现代医学把心脏病诊断非常清楚，可是就是治不好。花再多的钱
，也不能治本。疾病让人处于死亡边缘。最后只好求助大慈大悲的观世音菩萨。念大悲
咒和观音普门品。一天晚上，梦见美丽庄严得无以描述的观音菩萨来到我身前，用手在
我的胸前轻轻一点。然后就离开了。我很快就醒来，感觉病就好了。从此后，心脏病就
真好了。不需要吃药了。也能天天跑跑步。这种经历太神奇了。难道有如此的巧合？
与大家讨论。
现在继续读佛经，还有很多其他感应在此不细说。
（念大悲咒其实容易 每... 阅读全帖 |
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s*****l
发帖数: 263 | 24 梦见观音菩萨给我治病。或巧合？
本人自己是现代西医生 出国后有读了生物医学博士 由于在美国学习太累，加上申请绿
卡期间搞基因研究工作太辛苦 (both shRNA and targeting vector cloning)，竟得了
心脏病，美国最先进的现代医学把心脏病诊断非常清楚，可是就是治不好。花再多的钱
，也不能治本。疾病让人处于死亡边缘。最后只好求助大慈大悲的观世音菩萨。念大悲
咒和观音普门品。一天晚上，梦见美丽庄严得无以描述的观音菩萨来到我身前，用手在
我的胸前轻轻一点。然后就离开了。我很快就醒来，感觉病就好了。从此后，心脏病就
真好了。不需要吃药了。也能天天跑跑步。这种经历太神奇了。难道有如此的巧合？
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现在继续读佛经，还有很多其他感应在此不细说。
（念大悲咒其实容易 每天只需花半个多小时，好处多多，何乐而不为）。 |
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c**b
发帖数: 2999 | 25 【 以下文字转载自 Medicine 讨论区 】
发信人: syltool (基因治疗), 信区: Medicine
标 题: 梦见观音菩萨给我治病。或巧合？
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Jan 8 19:23:34 2011, 美东)
梦见观音菩萨给我治病。或巧合？
本人自己是现代西医生 出国后有读了生物医学博士 由于在美国学习太累，加上申请绿
卡期间搞基因研究工作太辛苦 (both shRNA and targeting vector cloning)，竟得了
心脏病，美国最先进的现代医学把心脏病诊断非常清楚，可是就是治不好。花再多的钱
，也不能治本。疾病让人处于死亡边缘。最后只好求助大慈大悲的观世音菩萨。念大悲
咒和观音普门品。一天晚上，梦见美丽庄严得无以描述的观音菩萨来到我身前，用手在
我的胸前轻轻一点。然后就离开了。我很快就醒来，感觉病就好了。从此后，心脏病就
真好了。不需要吃药了。也能天天跑跑步。这种经历太神奇了。难道有如此的巧合？
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现在继续读佛经，还有很多其他感应在此不细说。
（念大悲咒其实容易 每天只需花半个多小时，好处多多，何乐而不为... 阅读全帖 |
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d********f
发帖数: 43471 | 26 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: zhoumaomao (周毛毛), 信区: Biology
标 题: 被坑惨了，看看我这还做得下去吗？
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Jul 10 16:09:50 2013, 美东)
博后搞了个新field，虽然比较陌生，但是做着做着觉得做不下去啦！老板很老，以
前80年代90年代早期靠钓新基因发家的，整了一堆蛋白放那里。看看别人有什么新发现
，就拿出来再做一做。我目前做的这个蛋白，在此叫做A，在02年吧，有个牛人在其有
五六十页的专利的一个table里面列出来，说这个蛋白在一类淋巴瘤细胞里面表达量高
，估计跟这类淋巴瘤关系密切。应该是根据microarray得到的data来推论的。但是之后
牛人发了好多paper，关于这类淋巴瘤的，转录因子，蛋白激酶，做了一大堆，也测了
很多microarray 和RNAseq的data，但就是在其文章中找不到关于我做的这个蛋白A的只
言片语。我的老板写的grant，跟这个牛人实验室独立出来的一个老postdoc合写的，里
面有张WT电泳图要显示A在这类淋巴瘤细胞系里，相对... 阅读全帖 |
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w*****r
发帖数: 7106 | 27 【 以下文字转载自 Wisdom 讨论区 】
发信人: syltool (基因治疗), 信区: Wisdom
标 题: 梦见观音菩萨给我治病。或巧合？
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Jan 8 19:30:18 2011, 美东)
梦见观音菩萨给我治病。或巧合？
本人自己是现代西医生 出国后有读了生物医学博士 由于在美国学习太累，加上申请绿
卡期间搞基因研究工作太辛苦 (both shRNA and targeting vector cloning)，竟得了
心脏病，美国最先进的现代医学把心脏病诊断非常清楚，可是就是治不好。花再多的钱
，也不能治本。疾病让人处于死亡边缘。最后只好求助大慈大悲的观世音菩萨。念大悲
咒和观音普门品。一天晚上，梦见美丽庄严得无以描述的观音菩萨来到我身前，用手在
我的胸前轻轻一点。然后就离开了。我很快就醒来，感觉病就好了。从此后，心脏病就
真好了。不需要吃药了。也能天天跑跑步。这种经历太神奇了。难道有如此的巧合？
与大家讨论。
现在继续读佛经，还有很多其他感应在此不细说。
（念大悲咒其实容易 每天只需花半个多小时，好处多多，何乐而不为）。 |
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s*****l
发帖数: 263 | 28 梦见观音菩萨给我治病。或巧合？
本人自己是现代西医生 出国后有读了生物医学博士 由于在美国学习太累，加上申请绿
卡期间搞基因研究工作太辛苦 (both shRNA and targeting vector cloning)，竟得了
心脏病，美国最先进的现代医学把心脏病诊断非常清楚，可是就是治不好。花再多的钱
，也不能治本。疾病让人处于死亡边缘。最后只好求助大慈大悲的观世音菩萨。念大悲
咒和观音普门品。一天晚上，梦见美丽庄严得无以描述的观音菩萨来到我身前，用手在
我的胸前轻轻一点。然后就离开了。我很快就醒来，感觉病就好了。从此后，心脏病就
真好了。不需要吃药了。也能天天跑跑步。这种经历太神奇了。难道有如此的巧合？
与大家讨论。
现在继续读佛经，还有很多其他感应在此不细说。
（念大悲咒其实容易 每天只需花半个多小时，好处多多，何乐而不为）。 |
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m******t
发帖数: 109 | 29 work well? if yes. gonna order. thx |
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D***a
发帖数: 516 | 30 用293T细胞，转lentivirus病毒载体和gagpal+vsvg,产生的病毒是不是有一部分又感染
回到293T了？那这个会增加病毒产率（比如说感染回去，vector又可以被复制，产生新
的病毒）还是降低病毒产率（病毒被消耗掉了）？
我的一个shRNA病毒产量总是很低（一个是共转染之后293T荧光少（载体含GFP），另一
个是病毒infect target cell后筛选，得到的克隆少得多），跟control和另外一个
gene family isoform相比。我做了不加gagpal和vsvg,把载体单独转到293T里面，从
GFP荧光看plasmid质量没问题，跟control是一样的。查到有文章提到这个蛋白可以帮
助病毒entry，是不是就是病毒低的原因呢？
谢谢大家。 |
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D***a
发帖数: 516 | 31 那我的shRNA这个情况，应该是消耗减少了，得到的病毒应该更多啊。 |
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h******y
发帖数: 1374 | 32 为什么不自己去提质粒，做病毒呢
Open现在还有lenti的inducible shRNA vector,只需要一次infection
down |
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n********k
发帖数: 2818 | 33 promotor silencing is more common than what people might appreciate, it is
very common for one to have
resistent clones but without overexpression, in ur case would be shRNA, so u
would have to do western/rt-
pcr to check it out, as well, it is rare to keep viral infected cells as
stable line because it is widely
recoginzed/believed that the expression goes down dramatically after a
couple of passages...the same goes
with tranfected cells...so the rule of thumb in general is to not to use
them a |
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a******n
发帖数: 392 | 34 要表达shRNA是不是一定要U6或者H1这种type III RNA polymerase promoter? |
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d****i
发帖数: 2346 | 35 不一定。
xia haibin好像最早用了CMV promoter。现在陕西师大建了实验室。
还有就是如果你把你的shRNA涉及到内含子里面，转录后自动剪切，那么前面可以随便
用那种启动子。 |
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m**********d
发帖数: 137 | 36 用shRNA敲掉某蛋白，看对drug treatment的影响，有人建议我做克隆筛选。我不明白
为啥要做克隆筛选。谢谢指教 |
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h******y
发帖数: 351 | 37 Can you tell me which paper it is? Thank you very much. |
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a***e
发帖数: 1010 | 38 doesn't your shRNA inhibit translation, but not trigger slicing? |
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X***n
发帖数: 366 | 39 如果想看一段序列是否包含promoter，把这段序列克隆到luciferase上游看看能否
activate luciferase expression. 如果想看你design的shRNA能否work，把你的靶序
列克隆到luciferase的3'-UTR. microRNA同理。 |
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n**********1
发帖数: 251 | 40
有点懂了，那是不是luciferase就像GFP蛋白一样，通过外源性的序列，比如promoter
去启动它，或者通过shRNA去移植它，它就像一个指标一样，比较容易检测到啊？然后
就提示外源性序列的作用和活性啊？ |
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H*****e
发帖数: 120 | 41 I am interested in miRNA too recently but no previous experience. How do
you guys knockdown miRNA. There are a few methods in the literature. For
stable line, can regular shRNA work? Thanks! |
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j*****5
发帖数: 24 | 42 i am trying to making a SHRNA lentivirus vector ( pRNAT from Gene script),
however, i was unable to get positive clone, And the yield of the plasmid
is also very low ( around 200ng/ul) I used HB101 E.coli competent cells,
Anybody can help me out? Thanks in advance. |
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a*****n
发帖数: 2835 | 43 shRNA还是做成virus比较有效，siRNA有专门的转染试剂效率很高
谢。 |
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v*******a
发帖数: 759 | 44 how about lenti viral shRNA vector? |
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w****u
发帖数: 1078 | 45 最近打算使用RT方法作个对于人细胞的试验，不知道谁有这方面的protocol.
而且，使用这个Lentiviral Particle对人是否有危害，应该采取什么防护措施。
谢谢 |
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o**i
发帖数: 1165 | 46 lentivirus RNAi level II就可以了 |
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