n**t 发帖数: 45 | 1 【 以下文字转载自 Biology 讨论区,原文如下 】
发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标 题: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记(三)
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Thu Apr 28 17:44:52 2005) WWW-POST
本文献给YL
(三) 不溶的sigma32
四月六号早上,我们开始了第一模块的实验,Burgess教授负责。这老兄研究了一辈子E.Coli的RNA polymerase。E.Coli RNA polymerase 核心酶是一个蛋白质复合体,只有合成RNA的活性,却没有
识别DNA的能力。Sigma系列因子能够识别启动子, 并且与核心酶结合,从而实现转录。我们这个实验
的核心主角就是其中一个因子,叫sigma32。Sigma32可以识别heat shock genes的启动子。Sigma 32
过表达在大肠杆菌里面的时候,绝大部分形成了不溶的包涵体(inclusion body),我们的任务就是要用变性
剂溶解变性不溶的蛋白,然后做重折叠。
所有的buffer几乎都已经配好了 |
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r****o 发帖数: 105 | 2 本文献给YL
(三) 不溶的sigma32
四月六号早上,我们开始了第一模块的实验,Burgess教授负责。这老兄研究了一辈子E.Coli的RNA polymerase。E.Coli RNA polymerase 核心酶是一个蛋白质复合体,只有合成RNA的活性,却没有
识别DNA的能力。Sigma系列因子能够识别启动子, 并且与核心酶结合,从而实现转录。我们这个实验
的核心主角就是其中一个因子,叫sigma32。Sigma32可以识别heat shock genes的启动子。Sigma 32
过表达在大肠杆菌里面的时候,绝大部分形成了不溶的包涵体(inclusion body),我们的任务就是要用变性
剂溶解变性不溶的蛋白,然后做重折叠。
所有的buffer几乎都已经配好了,所以直接做就行了。我们先用1% Triton 来溶解细菌本身的一些蛋白,
inclusion body 相当稳定,不溶于triton,所以这一步,绝大部分垃圾就被去掉了。
下一步就是用变性剂来溶解inclusion body。用什么好呢?Burgess教授提到了sarkosyl。sarkosyl(N-十 |
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r****o 发帖数: 105 | 3 本文献给YL
(八)”液体DEAE“
绕了这么大一圈,现在再回到第一个模块的实验来。前面提到Dr.Burgess要我们
试Gudn HCl溶解sigma32之后的重折叠,结果很糟糕。我们接着试了用sarkosyl做
变性剂的蛋白重折叠。步骤和前一个类似,只是这一次是突然稀释至25倍体积。效果
好了很多,至少没有浑浊现象了。接着我们用Poros HS 50,一种阳离子交换柱,
来把可溶的sigma 分离了出来。为什么这一次用Poros HS 50 而不是前面用的阴离
子交换柱呢?因为sarkosyl带负电,会与阴离子交换柱结合得很好。再加上sigma32
很奇怪,既有负电的表面,又有带正电的表面,所以可以用阳离子交换柱。值得一提
的是绝大部分蛋白质都是偏酸性,所以阴离子交换柱用的比阳离子交换柱频繁得多。
好了,聊完离子交换柱,现在回到Dr Burgess要我们作的另一个很重要的实验。
Sigma32在大肠杆菌过表达的时候,绝大部分都是inclusion body,但是也有一部分
是可溶的。这些可溶的sigma 32可以和细菌体内的Core RNA polymerase结合形
成复 |
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n**t 发帖数: 45 | 4 【 以下文字转载自 Biology 讨论区,原文如下 】
发信人: royluo ( 罗马情结), 信区: Biology
标 题: 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记(八)
发信站: Unknown Space - 未名空间 (Fri Apr 29 11:14:36 2005) WWW-POST
本文献给YL
(八)”液体DEAE“
绕了这么大一圈,现在再回到第一个模块的实验来。前面提到Dr.Burgess要我们
试Gudn HCl溶解sigma32之后的重折叠,结果很糟糕。我们接着试了用sarkosyl做
变性剂的蛋白重折叠。步骤和前一个类似,只是这一次是突然稀释至25倍体积。效果
好了很多,至少没有浑浊现象了。接着我们用Poros HS 50,一种阳离子交换柱,
来把可溶的sigma 分离了出来。为什么这一次用Poros HS 50 而不是前面用的阴离
子交换柱呢?因为sarkosyl带负电,会与阴离子交换柱结合得很好。再加上sigma32
很奇怪,既有负电的表面,又有带正电的表面,所以可以用阳离子交换柱。值得一提
的是绝大部分蛋白质都是偏酸性,所以阴离子交换柱用 |
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