b******e
发帖数: 3348 | 1 问题可能有些弱智，老板要求转染某个基因的siRNA到一个动物细胞，以前我没做过
siRNA transfection,只用lipofectamine 2000转染过某基因的overexpress vector到
动物细胞，网上查了一下，dharmacon有这个基因的siRNA,是不是买了那个smartpool,
然后用lipofectamine 2000就可以转染了（当然成功与否，到不到50%得实验做了才知
道）,那个smartpool是四个RNAs的pool对吧，不知道这个过程是不是正确的。
菜鸟一个，敬请指教，非常感谢。如果有protocl能够让小弟看看那就更好了
包子答谢。
PS，不需要长期stock,所以暂时不考虑shRNA. |
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w********u
发帖数: 5457 | 3 基本是这么回事
我也用过，不过没做出来。。。：（ |
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c********l
发帖数: 244 | 4 Of course you can do it. Just follow the protocol for the transfection
reagent that you are going to use. I personally used hiperfect and
oligofectamine. |
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b**********8
发帖数: 349 | 6 小弟PhD第二年，一直在郁闷中度过，几度想退学，但是有没有后路，只得煎熬。
废话少说，言规正传吧，不知道大家有没有经历过这种情况。我们的project最初发现
一个基因（暂且称之为A）在肝癌组织和细胞株中普遍高表达，用shRNA方法敲出这个基
因后发现另一个与生长增殖有关的基因（称为B）表达水平也显著下调，在多个肝癌细
胞株里都能重复到这一结果，于是继续深入做了很多功能方面的研究。这一工作主要由
我前面的师姐完成，已经准备毕业答辩，文章也在修稿中，差不多快接受了。我来了后
老板让我继续研究A调节B的机制。后来因实验需要从Dharmacon公司买了针对A基因的
siRNA,是那种smartpool，就是四合一的那种，回来转染细胞后发现对A基因的沉默效率
几乎百分之百，但是不论怎样变换实验条件，就是观察不到原来对基因B的抑制效果，
从转染后第2天，一直到12天，中间还做过double transfection，始终没有结果。后来
实在没办法，把以前shRNA的序列发给Dharmacon公司，让他们合成siRNA,然后又能重复
到以前的现象。
我现在怀疑前面的A调节B的发现很可能是shRNA... 阅读全帖 |
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b**********8
发帖数: 349 | 7
当初确实设计了不同序列的两对shRNA,结果一样，只不过其中一对更为profound。这样
的话是不是可以排除shRNA的脱靶效应。
我后来比较了一下，两队shRNA分别target A基因的第1和第4个exon，后来买的
smartpool siRNA,其中两条也是target这两个exon，还有两条target 更靠近3'端，其
中好像有一条还target到3’UTR（记不清了），请问这个有什么影响吗？ |
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m*******m
发帖数: 127 | 8 我通常从Dharmacon买他们的SmartPool
效果很好，质量有保证, knockdown is almost guaranteed to work
令我头疼的是运货太慢，通常从下单到收到要超过7天，遇上节假日更慢。
大家有没有质量有保障，运货快的公司可推荐的？ |
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b**********8
发帖数: 349 | 9 如题，最近研究一个基因，发现敲掉他之后细胞增殖变慢，p53-p21激活，做flow 看
cell cycle发现有G1/S arrest，虽然统计学p小于0.05，但是看起来很marginal，特别
是转了control siRNA的细胞G1 比例都特别高，达到60%以上，请问这是怎么回事？有
什么好的trick吗？
tips：肝癌细胞株HepG2，转染control/smartpool siNRA targeting a gene 48小时候
收细胞，固定于70%的乙醇。 |
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d****i
发帖数: 2346 | 10 某基因S有三个isoform，我们western在细胞里只能看到2个isoform(1和2)的条带。
isoform 1
最长，isoform 2比1在N端少了一段，isoform 3又比isoform2在N端少了一段，也就是1
-2-3依次在N端少了一段。
然后从Dharmacon order了siRNA smartpool，KD以后western发现只有isoform 2被KD了
。理论上应该2被KD了，1肯定就被KD了。
请教有什么可能原因isoform1的蛋白水平仍然不变？
谢谢！ |
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