w******e
发帖数: 1187 | 1 conjugate to ssDNA/RNA using like NHS chemistry?
which
these
any |
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w******e
发帖数: 1187 | 2 thank you for your suggestion. I do have some sort of standard points
for my PCR (i.e., I can quantitate my PCR product reasonablly well).
However, if I don't have a way to accurately measure the amount of starting
RNA template, the whole thing wouldn't make sense.
right now, I use nanodrop to measure the template (which is short ssRNA),
and the standard points (which is short ssDNA). do you have any suggestion
on quantifying the amount more accurately? If I can nail these two,
the yield is easy |
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w******e
发帖数: 1187 | 3 I didn't know you can do that... so let me confirm: you mean, by anneal
a RNA oligo to a ssDNA template to make partial strand, the T7 polymerase
actually synthesize RNA by adding NTP to the existing RNA oligo, kinda
like a primer?
be |
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s******s
发帖数: 13035 | 4 谢谢。因为是seq的sample, 大小是一个smear, 几百bp到几kb，所以没法看大小。
同样，因为有的片断有几kp，我不是太放心这种大小的片断anneal效率怎么样，
有同学有经验么 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 5 把大片段再打碎一点，都控制在几百bp就不用担心anneal的效率了。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 8 没用过RACE kit
但是做过RACE
你要3'不？
基因多长？
我用的RLM-RACE，就是RNA ligase mediated RACE
你搜文献应该能搜到
具体就是利用RNA ligase可以连ssRNA+ssDNA
合成DNA oligomer，上面有一段adaptor sequence（跟你的目的基因/目的基因组没有
同源性就行），5’端和3’端都要-OH吧，然后RNA ligase会催化把这段DNA连到mRNA上
，再做1st strand cDNA synthesis
然后用gene specific reverse primer和adaptor forward primer (可以是你前面用的
adaptor，也可以重新设计引物，往里面来一点，做巢式PCR）来扩你要的基因
这样子好像应该比$740便宜很多 |
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s******s
发帖数: 13035 | 9 序列未知。
我试了一下random priming修成dsDNA，然后补平连接，不work. 可能是量太少，
或者是太小过柱太容易丢失。
现在考虑直接两头加Adaptor,然后pcr，这样会长一点多一点。有没有现成的protocol
可以用，或者大家有没有其他的好方法。
多谢了 |
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f**u
发帖数: 346 | 10 这种情况用ssDNA做recombineering是最好的，然后PCR盲筛。
400到500个colony里面肯定有你要的。 |
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h***e
发帖数: 146 | 11 先用recombineering引入一个counter selection marker, 然后用合成的ssDNA每端大
约50bp的同源臂，再次recombineering消去反向选择的marker，也不用盲晒，酶切鉴定
然后测序。我现在就在做点突变用这个方法，大约20kb，效率在10-20%左右 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 14 if long enough, try PCR. |
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E*********s
发帖数: 93 | 15 could you elaborate a little bit more how PCR can distinguish the two? |
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l**********1
发帖数: 5204 | 16 上图 SD its means
下图 SEM its mean
Btw,
降低 bias 就可能 增大 SEM的 error 拿测量甲地 乙地 女子的身高来作为例子
乙地的 习格格 陈小丹格格 的 身高 岂是 甲地的 芙蓉姐姐 凤姐等的身高 一样容
易测到的 哈 (NB: 钻 北方 南方地域贴的 请左拐 进菌版八区 在那里撸管)
pls refer
Sanjuan R.
From Molecular Genetics to Phylodynamics: Evolutionary Relevance of Mutation
Rates Across Viruses
PLoS Pathog. (2012) 8: e1002685.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3342999/
its pp5 left column
>To reducing bias, this method
accounts for phylogenetic relatedness (on the other hand, it
in... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 17 上图 SD its means
下图 SEM its mean
Btw,
降低 bias 就可能 增大 SEM的 error 拿测量甲地 乙地 女子的身高来作为例子
乙地的 习格格 陈小丹格格 的 身高 岂是 甲地的 芙蓉姐姐 凤姐等的身高 一样容
易测到的 哈 (NB: 钻 北方 南方地域贴的 请左拐 进菌版八区 在那里撸管)
pls refer
Sanjuan R.
From Molecular Genetics to Phylodynamics: Evolutionary Relevance of Mutation
Rates Across Viruses
PLoS Pathog. (2012) 8: e1002685.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3342999/
its pp5 left column
>To reducing bias, this method
accounts for phylogenetic relatedness (on the other hand, it
in... 阅读全帖 |
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j******i
发帖数: 939 | 18 ssDNA是怎么形成的呢。切出来的胶也就是用50来度加热啊，好像不至于都变性了啊。
the
will |
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K**4
发帖数: 1015 | 19 这个文章提出的DNA-guidedDNAinterference by bacterial Argonaute (or PIWI) 好
像不是很充分阿。首先他自己的实验也表明，Argonaute即结合RNA也结合DNA。
Analysis of co-purifiednucleicacidsrevealedthatTtAgo-associatedRNA (10–150
nucleotides) is preferentially 32 P-labelled in a polynucleotide kinase (PNK
) forward reaction, indicating the presence of 5' hydroxyl groups (Extended
Data Fig. 1c). By contrast, co-purified DNA has a more defined length (13–
25 nucleotides), and is preferentially labelled in a PNKexchangereaction,
indicatingph... 阅读全帖 |
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K**********t
发帖数: 42 | 20 我用这个去染色M13 DNA, 为什么还是没荧光，是因为在pM上荧光太弱吗？？？ |
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l*********i
发帖数: 332 | 21 ssDNA oligo as donor, puro screen, should be easy~ |
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j******i
发帖数: 939 | 23 转染效率跟哪种细胞有关。CRISPR+ssDNA要拿到想要的克隆还是挺费劲的。可以考虑
CRISPR+piggybac＋puroTK的结合来筛选克隆。 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 24 Yes,the DNA should be fine for transcription template. If you load on a
gel, you may even see ssDNA bands.
Better elude in TE. However if elude in ddH2O, you can add some NaCl
solution to 100 mM.this helps to form dsDNA. |
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m*********D
发帖数: 1727 | 25 我需要突变的区域大了一点，有60-70bp的间隔，所以，不能合成ssDNA.
谢谢！ |
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t*******w
发帖数: 107 | 26 very neat work~
28/54 successfully spliced
4/28 successfully recombined using ssDNA oligos.
basically, only 4/54 (7.4%) worked for the purpose of therapeutics in
treating Beta-thal.
Considering that 2 off-target sites were founded in 6 samples by exome seq,
the odds to select a healthy (not considering non-coding region mutation)
working embryo is less than 1.5%~.
The therapeutic value in treating inborn error is none in a forseeable
future. But it is a very strong tool in animal gene editing.
A... 阅读全帖 |
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l***y
发帖数: 638 | 27 11个中的7个用的是体内的同源基因做的模板，只有4个实际用的是外源提供的ssDNA做模
板修复，4/86的效率比negative实在好不到哪里去 |
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h****a
发帖数: 65 | 28 我是新手，正准备做crispr point mutant, 很多问题想请教
1. Crispr载体选择， px330, px335(nickase), px459(puro+), px462(nickase,
puro+)
Nickase的系列在做KO的时候效率会高些，不知道做knock-in mutation哪种效率更高？
你所说的selection marker是crispr载体上带的selection marker(eg.
Puro+), 还是donor上带的selection marker? 我准备用ssDNA做donor, 做点突变的
时候好像也不方便在donor上引入selection marker
2. 你是在donor 上引入酶切位点（通过silence mutation）, 然后PCR酶切鉴定吗？
3. 一般knock-in mutation挑克隆都挑一百个克隆以上，具体操作的时候，是不是
在大板上有单克隆后，转96孔板里面，然后duplicate， 其中一板用来做PCR鉴定？做
PCR鉴定的模板是96孔板里面的细胞提取的g... 阅读全帖 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 29 1. Crispr载体选择， px330, px335(nickase), px459(puro+), px462(nickase,
puro+)
Nickase的系列在做KO的时候效率会高些，不知道做knock-in mutation哪种效率更高？
你所说的selection marker是crispr载体上带的selection marker(eg.
Puro+), 还是donor上带的selection marker? 我准备用ssDNA做donor, 做点突变的
时候好像也不方便在donor上引入selection marker
**我用的459，主要是要它的puro-selection。这个是筛选transfected cells的。也可
以用带GFP的vector,作cell sorting. 我原文说的selection和这个无关，是指有HDR发
生后的筛选。是，这个selection marker是一个头疼事，我也不太熟悉。
2. 你是在donor 上引入酶切位点（通过silence mutation）, 然后PCR酶切鉴定吗？
*... 阅读全帖 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 30 你这样的问题我已经碰到很多人问了。我只能说不容易。我用的donor
不是ssDNA,但怎么克隆一个selection marker进去，又不影响感兴趣基因的splicing,
我还没有想出办法。除非你的突变点靠近后面的UTR,而UTR又比较小，你才有可能加在
你的基因后面。
按我作high-through put的思维，你最好作dilution method,一个well里平均放100个
细胞，然后duplicate每个well, 一个提DNA,PCR，genotyping。再把阳性的well细胞（
duplicate)dilute到single细胞per well，在genotype。这样，你一百个well/PCR能覆
盖10000个单细胞，还没有，就该放弃了。 |
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s***e
发帖数: 911 | 31 你说的这种是特定的重要生物过程信号通路里的Mechanoisensing. YAP/TAZ的
subcellular localization肯定受力调控，这个是已经实验确定的。Notch pathway
notch receptor cleavage也已经知道是受力调控的。刚才我顺手google, 发现也有很
多文献报道wnt pathway也直接受力调控。这些实验表明力可以是调控重要生物过程的
重要因素，不代表是必要因素。所以你的结果其实和Hippo mechanosensing没有显著茅
盾。对了，能分享一下你怎么通过knockout模型来讨论hippo和mechanosensing的联系
的？还想请教一下YAP在细胞质内是和那些蛋白相互作用？我对hippo mechanosensing
很感兴趣，但是对hippo相关的生物基本不了解。正在自学。
除了这些有名字的信号通路，mechanosensing在cell-ECM连接，cell-cell连接, cell
migration, tissue maintenance, 离子通道, actin stabilization, mus... 阅读全帖 |
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g*****s
发帖数: 1016 | 32 各位前辈，
小弟最近用magnetic beads (coated with steptavidin)去pull down biotin ssDNA.
在pulldown以后，我有一步工序是加热beads到80摄氏度。我发现streptavidin会从
bead上脱落下来。我洗过很多遍，都是一样的问题。我想知道有没有什么方法能够阻止
这种脱落，谢了！ |
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H****s
发帖数: 301 | 33 谢谢了。我收集有各种正常以及疾病组织的cDNA，有想法把他们做成全长的cDNA文库。
目前来看，只有给ssDNA加linker这个选择了。 |
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c**i
发帖数: 265 | 34 ssDNA的话，直接就可以当引物合成了，也比rna稳定。 |
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x****6
发帖数: 4339 | 35 谢谢你提供的信息，我看了一下，这片文章发现的蛋白质只针对ssDNA和超螺旋的质粒
DNA，所以不可与河北这个组发现的蛋白同日而语。但是有可能前者给后者启发了灵感
。读到14年的文章之后，大家玩命的去试那个蛋白的同源蛋白，运气好的人就试出来了
。而CRISPR/Cas9的那帮大佬们太自信，看不上这些野路子，一如既往的在cas9系统上
砸资源进行优化，最后傻X了：无名之辈竟然找到了天生丽质、不加雕琢就把Cas9比下
去的系统。 |
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n********k
发帖数: 2818 | 36 肯定是内行了。有两点评论请教或问题哈：
1） 这个我昨天看到时候也很激动，但是仔细考虑了下，它的应用比CAS9的路障估计要
多太多，正是因为它太优美了，需要的东西太少，那么从临床治疗角度它可能出现的胞
内的ssDNA会大规模增加它可能的off target---所以它的优势潜在地是它致命的劣势，
这个不确定性对于临床转化是致命的；但作为研究工具，如果果真像文章所言，那么我
觉得很快如果不取代Cas9，至少也会同CAs9平分天下；
关于这个新技术，我现在已经有N多的想法做什么了，但是需要人手呀！！！而且必
须快手，当年Douna文章一出来（不是张峰的文章出来），我就设计了7个课题，两个我
们还在干,一个我们投入最大的，后来发现理论上非常牛，非常好，现实操作上可行性
是无，光大提的试剂盒估计得用至少4000个以上：）））（不过我们还在想替代的办法
，日本人去年的一篇文章让我对这个课题又有了重开的兴趣，不过需要强大的技术骨干
才行）， 其他都眼睁睁看别人发CNS....
2）第二iPS获诺奖是必然而且是well deserve,尽管我从来都没有觉得IPS可以走通临床
，包括日本眼睛的尝... 阅读全帖 |
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n********k
发帖数: 2818 | 37 大家想得是否太多了点，这个技术如果不能解决胞内潜在ssDNA的导向所致的off
target的问题，那么它的临床转化的价值是非常低的.... |
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z*t
发帖数: 863 | 38 RNA其实没那么难做，尤其sgRNA.不过这个基本上任意dna可以修饰了。
比较麻烦的一点是ssDNA对细胞有一定毒性
：1. DNA 比RNA更稳定，working with RNA is a pain in the ass.
：2. 削减了gRNA并非用于matching的冗余部分，精简了Primer
：PAM对于精确任意修改DNA(这是这个技术的selling point之一)是非常重要的阻碍。我
：认识
：的几个做CRISPR的实验室都在尝试解决这个问题。
：这几点看上去可能没什么大不了的，但是要知道crispr/cas9之所以热，并不是因为它
：实现了什么以前不能做的事，只是让以前很难做的事现在变的容易了。让真核生物的
基因组改造普及化；而这个技术有潜力让基因组改造白菜化。 |
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x****6
发帖数: 4339 | 39 1）我觉得现在来讲临床应用有点太早，就算是已经被MIT,伯克利这种顶级学院研究了
几年的crispr/cas9都还没有奢望临床应用。
更何况，就如同crispr/cas9现在正在被修改、优化，这个系统也可以被修改和优化。
我自己对蛋白质定向进化比较熟悉，完全可以设想对这个蛋白进行大规模突变，来寻找
只识别带有DNA 5'特殊、人工修饰（比如乙酰化，在生物里不存在）的ssDNA的突变子
，来降低off targeting的风险。
2）关于iPS的意义我和你的理解不太一样。我认为主要不在理论，而在于实现的结果。
据我一个听过山中申弥讲座的朋友介绍，当时有人问他怎么找到那四个TF的，他说完全
是试出来的，试了N多，最后运气好，出来了。就是到现在也没有一个convincing的理
论来解释。那么既然是结果重要，那么这个工作的意义在于1）为研究发育提供了技术
平台，比如james thomson现在基本该行去做老板，开了个cellular dynamics,专门卖
ips的细胞系；2）对于再生医学的临床应用的潜在意义：用病人自己的组织诱导培养出
脏器，移植给自己。 |
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c*********r
发帖数: 1312 | 40 "来寻找只识别带有DNA 5'特殊、人工修饰（比如乙酰化，在生物里不存在）的ssDNA的
突变子，来降低off targeting的风险"
很赞！
这个Natronobacterium本来就是古菌，随着被测序的物种越来越多，在这些奇奇怪怪非
常见的生物里，肯定会有越来越多的新奇的分子、通路被发现，再加上人工改造、筛选
、进化，肯定会有很牛很牛的应用的。做生物的生物信息的一定要联合起来，眼光开阔
一点，肯定有越来越多的有价值的东西被挖掘开发出来。
关于off target，根据你的这点提示，有没有人尝试在一些存在人所不含有的特殊修饰
的动物、植物、细菌、古菌、真菌里找找NgArgonaute的同源或者同功蛋白，看看有没
有哪些有开发价值的。多年做生物的知识积累加上bioinformatics技术，肯定能挖出不
少东西。
如果挖不出来，用你的特长定向进化也是很牛很牛的！ |
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j****n
发帖数: 3370 | 42 in vivo表达的是不是没有5'端磷酸化？
ssDNA |
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x****6
发帖数: 4339 | 43 如果同一个细胞内存在携带同源片段的ssDNA,按照这个模板进行的同源重组修复会有一
点比例 |
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发帖数: 1 | 44 楼主，我有一个不懂 的地方，可能是common sense，但是我正好不懂，不要见笑。
1.一般来说Ago蛋白C端加tag，无论是来自于那个物种，蛋白就没有活性了，主要由Ago
蛋白自身结构folding决定。文中用的几个construct，好像只有1-2个C端是没有tag的
。那么，用C端带tag的Ago作出的实验，是否有意义呢？当然，不能够排除NgAgo本身特
殊，能够tolerate C端tag，只是从预测的结构上讲，可能性很小。
有没有paper报道在Ago蛋白的C端加tag会使其活性消失或者降低？最好在这里列几篇参
考文献。因为我以前对于好几个蛋白质在C端加FLAG,GFP，都不会影响蛋白的功能，对
于Ago家族的蛋白，我不了解。
2.Ago催化酶切的核心domain实际是一个RNaseH fold，催化cleavage时应该结合双链（
无论DNA或RNA），而双链其中一个是guide，另外一个是target。我无法想象gDNA
guided NgAgo是如何切割双链DNA的。文章开始用2个guide，也许还有些道理（说不定
细胞DNA会有瞬时的单链状态）；后来直接上一个gu... 阅读全帖 |
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y****m
发帖数: 37 | 45
楼主，我有一个不懂 的地方，可能是common sense，但是我正好不懂，不要见笑。
1.一般来说Ago蛋白C端加tag，无论是来自于那个物种，蛋白就没有活性了，主要由Ago
蛋白自身结构folding决定。文中用的几个construct，好像只有1-2个C端是没有tag的
。那么，用C端带tag的Ago作出的实验，是否有意义呢？当然，不能够排除NgAgo本身特
殊，能够tolerate C端tag，只是从预测的结构上讲，可能性很小。
有没有paper报道在Ago蛋白的C端加tag会使其活性消失或者降低？最好在这里列几篇参
考文献。因为我以前对于好几个蛋白质在C端加FLAG,GFP，都不会影响蛋白的功能，对
于Ago家族的蛋白，我不了解。
----见上
2.Ago催化酶切的核心domain实际是一个RNaseH fold，催化cleavage时应该结合双链（
无论DNA或RNA），而双链其中一个是guide，另外一个是target。我无法想象gDNA
guided NgAgo是如何切割双链DNA的。文章开始用2个guide，也许还有些道理（说不定
细胞DNA会有瞬时的单链状态）；后... 阅读全帖 |
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m****a
发帖数: 270 | 46 你可能理解错了，这个AGO在体外并非只能切单链，作者发现转染NgAgO和ssDNA的293细
胞中提取出的NgAgo能在“体外”切割双链质粒（Supplementary Figure 1）。
另外NgAgo并不能切单链DNA，这一点和TtAgo就完全不同。 |
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s*****i
发帖数: 315 | 47 我试了两次，没有做出来，完全用韩写的protocol做的，而且试过了分别转质粒和
oligo。正对照是CRISPR-Cas9, target 同一个 exon，所以做的Surveyor assay 没问
题。
质粒的转染效率有80%，因为共转了EGFP质粒并做了FACS。
也许是我手臭吧。有没有共转质粒和ssDNA比较好的protocol？ |
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l***s
发帖数: 841 | 48 你动手够快的。我们实验室还在克隆Ago。。。ssDNA应该比质粒好转，共用质粒
protocol就行了。听你这么说，情况不乐观啊。NLS signal加了吗？韩自己也说目前的
系统不完善，建议从切GPFplasmid底物开始。看了还有很多工作要做。但希望不是个大
泡泡。 |
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r********s
发帖数: 149 | 49 我也试了一次，没做出来。现在准备用他们的gata4来做positive control.
[在 samalli (小米) 的大作中提到：]
:我试了两次，没有做出来，完全用韩写的protocol做的，而且试过了分别转质粒和
:oligo。正对照是CRISPR-Cas9, target 同一个 exon，所以做的Surveyor assay 没问
:题。
:质粒的转染效率有80%，因为共转了EGFP质粒并做了FACS。
:也许是我手臭吧。有没有共转质粒和ssDNA比较好的protocol？
:天下熙熙，皆为利来；天下攘攘，皆为利往。 |
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r********s
发帖数: 149 | 50 如果他们号称在293T里可以切endogenous gene, why bother using GFP plasmid?
[在 laghs (微小) 的大作中提到：]
:你动手够快的。我们实验室还在克隆Ago。。。ssDNA应该比质粒好转，共用质粒
:protocol就行了。听你这么说，情况不乐观啊。NLS signal加了吗？韩自己也说目前
的系统不完善，建议从切GPFplasmid底物开始。看了还有很多工作要做。但希望不是个
大泡泡。 |
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